בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות
Summary
אנו מדווחים על שיטה לבודד מבשר עור נגזרות נאיביים multipotent (SKP) תאים פיברובלסטים מתרבויות האנושיות העיקריות. אנו מראים כי SKPs אלה נגזרים מתרבויות פיברובלסטים חולקים מאפיינים של תאי גזע דומים לאלה שנגזרים ישירות מביופסיות עור אדם. תאים אלה מבטאים את סמן הרכס העצבי, nestin, בנוסף לסמני multipotent כגון Oct4 וNanog.
Abstract
במהלך העשור האחרון, מספר אוכלוסיות תאי גזע בוגרים זוהו בעור אנושי 1-4. הבידוד של מבשרי עור מבוגרים multipotent דווח לראשונה על ידי מילר פ D מעבדה 5, 6. מחקרים המוקדמים אלה תאר אוכלוסיית תאי מבשר multipotent מהדרמיס יונקים בוגרים 5. תאים אלה – SKPs כינה, למבשרי עור נגזרים – היו מבודדים והתרחבו ממכרסמים ועור אנושי ומובחן לצאצאים הן עצביים וmesodermal, כולל סוגי תאים לא נמצאו בעור, כגון תאי עצב 5. מחקרי immunocytochemical על SKPs תרבית גילו כי תאים הביעו vimentin וnestin, חלבון נימה ביניים באו לידי ביטוי בשרירי מבשרי עצבים ושלד, בנוסף לפיברונקטין וסמני תאי גזע multipotent 6. עד עכשיו, את SKPs אוכלוסיית תאי גזע הבוגרים היו מבודד מביופסיות עור יונקים טריים שנאספו.
ve_content "> לאחרונה, הקמנו ודיווחתי כי אוכלוסייה של תאים מבשר נגזרים עור יכולה להישאר קיימת בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות שנקבעו מביופסיות עור 7. ההנחה שכמה תאי גזע הסומטיים אולי מתגוררים בתרבויות פיברובלסטים ראשוניות באוכלוסיית הכפלות הייתה מוקדמות בהתבסס על תצפיות אלה: (1) SKPs ותרבויות פיברובלסטים העיקריות נגזרים מדרמיס, ולכן מספר קטן של תאי SKP יכול להישאר קיים בתרבויות פיברובלסטים עורי הראשוני ו( 2) תרבויות פיברובלסטים ראשוניות גדלו מ aliquots הקפוא שהיו נתון שלילי הטמפרטורה במהלך אחסון או ההעברה הכיל מספר קטן של תאים שנותרו קיימא 7. תאים נדירים אלה היו מסוגלים להרחיב ואפשר היה passaged מספר פעמים. תצפית זו הציעה כי מספר קטן של תאים עם עוצמה התפשטות גבוהה והתנגדות ללחץ היו קיימים בתרבויות האנושיות פיברובלסטים 7.אנחנו ניצל את הממצאים אלה להקמת פרוטוקול לבידוד מהיר של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים העיקריות הזמינים בקלות מבנקי רקמות ברחבי העולם (איור 1). לשיטה זו משמעות חשובה שכן היא מאפשרת בידוד של תאים מבשר כאשר דגימות עור אינן נגישים תוך תרבויות פיברובלסטים עשויות להיות זמינות מבנקי רקמות, ובכך, פותחות הזדמנויות חדשות לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלות גנטיות נדירות כמו גם מחלות בדוגמנות מנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בשיטה המתוארת במסמך זה, ניתן לבודד תאי גזע עורי נאיבי מתרבויות פיברובלסטים עורי ראשוני. שימוש בגישה זו, לאחרונה דיווחו בידוד והאפיון של תאי גזע בוגרים מתרבויות פיברובלסטים שמקורם בחולים עם תסמונת גנטית נדירה, האצ'ינסון-גילפורד progeria תסמונת 7. כמו להראות …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן אלכסנדר פון הומבולדט (5090371), המרכז לחקר כריסטין Kühne אלרגיה וחינוך (CK-CARE), וStaatsministerium Bayerischen (לKD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
