初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ成人幹細胞の分離
Summary
私たちは、初代ヒト線維芽細胞培養からナイーブ多能皮膚由来の前駆体（SKP）細胞を単離する方法を報告する。我々は、線維芽細胞培養物に由来するこれらのSKPsは、ヒト皮膚生検から直接誘導されるものに類似した幹細胞の特性を共有することを示している。これらの細胞は、そのようなOCT4とNanogのような多能性マーカーに加えて、神経堤マーカー、ネスチンを発現。
Abstract
過去10年間で、いくつかの成体幹細胞集団はヒトの皮膚1-4に同定されている。多能成人皮膚前駆体の単離は、最初の6ミラーF. D実験室5、により報告された。これらの初期の研究では成体哺乳類の真皮5から多能性前駆細胞集団を記述した。これらの細胞は-と呼ばSKPs、皮膚由来の前駆体のためには、 -単離され、げっ歯類とヒトの皮膚から拡大し、そのようなニューロン5などの皮膚に見たことがない種類の細胞を含む神経と中胚葉の両方の子孫へと分化させた。培養SKPs上の免疫細胞化学的研究は、細胞は、フィブロネクチンおよび多能性幹細胞マーカー6に加えて、ビメンチンおよびネスチン、神経および骨格筋において発現前駆体中間体フィラメントタンパク質を発現することを明らかにした。今までは、成体幹細胞集団のSKPsを、新たに収集された哺乳動物の皮膚生検から単離されている。
ve_content ">最近、我々は皮膚の人口に由来前駆細胞は、皮膚生検7から確立された主要な線維芽細胞培養中に存在し続けたことを確立し、報告している。少数体性幹細胞は、早期の集団倍加一次線維芽細胞培養にある可能性があることは前提だった（1）SKPs及び一次線維芽細胞培養は、真皮から誘導されるので、SKP少数の細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物とされている凍結アリコートから成長した（2）一次線維芽細胞培養物中に存在残る可能性が以下の観測結果に基づいて7生残った少数の細胞を含有する貯蔵又は転送時に好ましくない温度にさらさこれらの稀な細胞を数回拡大すると、継代され得ることができた。この観察は示唆高い増殖能やストレスに対する抵抗性を有する細胞の数が少ないヒト線維芽細胞培養7に存在していた。我々は、世界中の組織バンク（ 図1）から容易に入手可能である一次線維芽細胞培養からの成体幹細胞の迅速な分離のためのプロトコルを確立するために、これらの知見を利用した。線維芽細胞培養がで稀な遺伝性疾患と同様にモデリング疾患の根底にある分子機構を分析するための新しい機会を開くため、組織バンクから入手可能かもしれないが皮膚サンプルにアクセスできないときには前駆細胞の単離を可能にするため、この方法では、重要な意義を持っているディッシュ。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載した方法を用いて、ナイーブ皮膚幹細胞は、一次皮膚線維芽細胞培養物から単離することができる。このアプローチを使用して、我々は最近まれな遺伝症候群、ハッチンソン·ギルフォード早老症候群7患者由来線維芽細胞培養からの成体幹細胞の単離と特性を報告した。としてそれらの前駆細胞を発現幹細胞マーカーは自己再生が可能であり、（お願いヴェンツェル<e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アレクサンダー·フォン·フンボルト財団（5090371）、アレルギーの研究教育のためのクリスティンキューネセンター（CK-CARE）、およびバイエルンStaatsministerium（KDへ）によってサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
Referências
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