Naive Adult Stem Cells Isolasjon fra primære humane fibroblastkulturer

Summary

Vi rapporterer en metode for å isolere naive multipotent hud-derived forløper (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser at disse sKPs avledet fra fibroblastkulturer dele lignende stamcelleegenskaper til de som stammer direkte fra menneskelig hud biopsier. Disse cellene uttrykke neural crest markør, nestin, i tillegg til de multipotent markører som OCT4 og Nanog.

Abstract

I løpet av det siste tiåret har flere voksne stamceller populasjoner blitt identifisert i menneskelig hud ^1-4. Isolering av multipotent voksne dermal forløpere ble først rapportert av Miller F. D ^{5 laboratorium, 6.} Disse tidlige studiene beskrev en multipotent forløper celle befolkningen fra voksen pattedyr dermis ^fem. Disse cellene – kalt sKPs, for hud-deriverte forløpere – ble isolert og utvidet fra gnagere og menneskelig hud og differensiert i både nevrale og mesodermal avkom, inkludert celletyper aldri funnet i huden, slik som nevroner ^fem. Immuncytokjemisk studier på kultiverte sKPs avdekket at cellene uttrykte vimentin og nestin, en mellomliggende filament protein uttrykt i nevrale og skjelettmuskulatur forløpere, i tillegg til fibronectin og multipotent stamcelle markører ^seks. Inntil nå har de voksne stamceller befolkningen sKPs vært isolert fra ferske innsamlede pattedyr hud biopsier.

ve_content "> Nylig har vi etablert og rapporterte at en befolkning på hud avledet forløper celler kunne være tilstede i grunnskolen fibroblastkulturer etablert fra hud biopsier ^7. Antakelsen om at noen somatiske stamceller kan ligge i grunnskolen fibroblastkulturer på tidlige befolkningen doublings var basert på følgende observasjoner: (1) sKPs og primære fibroblastkulturer er utledet fra dermis, og derfor et lite antall SKP celler kan være tilstede i dermale primære fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer dyrket fra frosne alikvoter som har vært utsettes for ugunstig temperatur under lagring eller overføring inneholdt et lite antall celler som forble levedyktige ^7.. disse sjeldne cellene var i stand til å utvide seg og kan passeres flere ganger. Denne observasjon antydet at et lite antall celler med høy spredning potens og resistens mot stress var til stede i menneskelige fibroblastkulturer ^7.

Vi benyttet av disse funnene for å etablere en protokoll for hurtig isolering av voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer som er lett tilgjengelig fra vev bredden over hele verden (se figur 1). Denne metoden har viktig betydning som det lar isolering av forløper celler når huden prøver er ikke tilgjengelig mens fibroblastkulturer kan være tilgjengelig fra vev banker, og dermed åpner nye muligheter til å dissekere de molekylære mekanismene bak sjeldne genetiske sykdommer samt modellering sykdommer i en parabolen.

Protocol

En. SKP Isolasjon fra Primær fibroblastkulturer Fibroblastkulturer enten fra celle banker eller direkte oppnådd fra hud biopsier blir opprettholdt i kultur i fibroblastvekstfaktor medium DMEM inneholdende 15% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin. Menneskelige fibroblaster GMO3349C og GMO8398A ble innhentet fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, New Jersey), og ble brukt i denne studien. Kult…

Representative Results

Vi viser at en populasjon av celler som selektivt utvider å generere SKP sfærer under kontrollerte vekst tilstand bestående av EGF og FGF2 er til stede i grunn-dermale fibroblastkulturer (figur 1) som vi nylig rapportert 7.. Fibroblastkulturer fra PPD-er 15 til 25 som vanligvis svarer til de primære fibroblaster stammer er tilgjengelige fra celle banker ble brukt i denne studien. Fibroblastkulturer innsendt til dobbel behandling bestående av kald temperatur b…

Discussion

Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet heri, kan naive dermale stamceller bli isolert fra primære fibroblastkulturer dermale. Ved hjelp av denne tilnærmingen, vi nylig rapporterte isolering og karakterisering av voksne stamceller fra fibroblastkulturer stammer fra pasienter med en sjelden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom ^7. Som viser her de forløper celler uttrykker stamcelle markører er i stand til selvfornyelse og kan rettes til å differensiere i ulike cellulære linjene inkluder…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.