تحليل Transcriptomic من العينات الجراحية الإنسان الشبكية عن طريق مجلة
Summary
استخدمنا عينات من شبكية العين retinectomy لتحليل transcriptomic من انفصال الشبكية. وضعنا الداخلي الذي يسمح بحفظ RNA بين الكتل الجراحية والمختبرية. نحن موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل ميكروأري.
Abstract
انفصال الشبكية (RD) يصف انفصال الشبكية العصبي الحسي من الظهارة الصباغية الشبكية (RPE). قواعد الإجراءات والإثبات أمر ضروري من أجل وظيفة طبيعية من الخلايا العصبية الحساسة للضوء، ومبصرات. انفصال الشبكية من قواعد الإجراءات والإثبات يخلق فجوة المادية التي يتم تعبئة مع السائل خارج الخلية. RD يبادر الأحداث السلبية الخلوية والجزيئية التي تؤثر على كل من شبكية العين العصبي الحسي وقواعد الإجراءات والإثبات منذ تبادل الفسيولوجية للأيونات ونواتج الأيض ومنزعجة بشدة. ويرتبط العاقبة للرؤية لمدة مفرزة منذ reapposition السريع لاثنين من الأنسجة النتائج في استعادة الرؤية 1. علاج RD هو الجراحية حصرا. ويتبع إزالة هلام الجسم الزجاجي (استئصال الزجاجية) عن طريق إزالة جزء غير أساسي من شبكية العين في جميع أنحاء منطقة منفصلة لصالح انفصال الشبكية. العينات الشبكية إزالة هي بلا مالك (لا شيء) وبالتالي التخلص منها بشكل طبيعي.لاستعادة الحمض النووي الريبي من هذه العينات الجراحية، قمنا بتطوير مجلة الإجراء الذي يسمح بحفظ RNA أثناء نقل من كتلة الجراحية إلى المختبر. نحن أيضا موحدة بروتوكول لتنقية الحمض النووي الريبي التي كتبها السيزيوم كلوريد تنبيذ فائق للتأكد من أن الرنا المنقى هي مناسبة لتحليل التعبير الجيني العالمي. جرى التحقق من نوعية الحمض النووي الريبي على حد سواء من قبل RT-PCR وتحليل ميكروأري. تحليل البيانات يظهر تورط في وقت واحد من الالتهابات وانحطاط مبصرة خلال RD.
Introduction
الهدف العلاجي الرئيسي في انفصال الشبكية (RD) هو إيجاد وسيلة للحد من تلف الخلايا المستقبلة للضوء والتهاب شبكية العين الناتجة عن فصل مبصرات من الخلايا الظهارية المصطبغة الشبكية. خلال RD، يتم تنشيط خلايا RPE، ترحيل، dedifferentiate، وتتكاثر على سطح الشبكية منفصلة، وممارسة القوات مقلص مما يؤدي إلى مضاعفات. تحليل Transcriptomics من RD هو وسيلة لتحديد الجينات المستهدفة مع التعبير بعد تعديل RD والجزيئات العلاجية بالتالي المستقبلية التي يمكن أن تحسن نتائج البصرية النهائي في تركيبة مع الجراحة. ومن المعلوم حمض النووي الريبي (RNA) ليست مستقرة كما هو حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA)، وهذه الأخيرة تستخدم على نطاق واسع للدراسات الجينية واستقراره سمحت تسلسل الجينوم النياندرتال من العينات الحفرية من أكثر من 30،000 سنة 2. النسخ من الحمض النووي من الجينات من الجينوم في الحمض النووي الريبي هو رسولعملية كبيرة في التعبير الجيني، ومرنا غير قابل للتغيير من أجل يشكل إشارة. الرنا هي جدا المتدهورة بسرعة عن طريق الانزيمات التي ريبونوكلياز إنهاء إشارة. عندما يتم عزل الأنسجة من كائن حي، والرنا غالبا ما تكون متدهورة قبل أن يتم درس التعبير في مختبر الأبحاث. ليست مناسبة RNA المتدهورة للتحليل التعبير الجيني. لأن موظفي المختبرات لا يمكن أن تشارك في عملية جراحية، وضعنا الداخلي التي هي سهلة وتتطلب فقط أن الجراح لاسترداد الأنسجة إلى حل ريبونوكلياز خالية من مناسبة. الحمض النووي الريبي من الأنسجة غير مستقرة ويمكن تحليلها دون أي علامة على تدهور بعد 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة في هذا الحل. يتم تنقية الرنا من العينات بطريقة موحدة تنطوي على تنبيذ فائق على التدرج كلوريد السيزيوم بعد أن تم نقلها إلى المختبر 3. ثم، يتم تقييم جودة الرنا بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام وRT-PCR. بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي لديهميزة فصل الجزيئات وفقا لكثافتها التي تختلف عن DNA و RNA ويؤكد أن الحمض النووي الريبي هو غير ملوثة من قبل جزيئات الحمض النووي من شأنها أن تولد إشارات مصطنعة في دراسات التعبير الجيني. وبالإضافة إلى ذلك، يتم فصل الرنا نقل (tRNAs)، والتي هي من الناحية الكمية الحمض النووي الريبي الأكثر وفرة داخل الخلية، وفقا لنفس الممتلكات المادية من الحمض النووي الريبي الريباسي (rRNAs) والرنا المرسال (mRNAs و)، تلك الماضيين واحد يجري المنتج النهائي من عملية تنقية. إزالة الحمض الريبي النووي النقال من إعداد مفيد لأن معظم البروتوكولات التحليلية ميكروأري ينطوي على استخدام transcriptases العكسي وبلمرة RNA التي تحول دون الحمض الريبي النووي النقال 4-6. وصفت الحمض النووي الريبي تنقيته من العينات الجراحية باستخدام بروتوكول قياسي والمهجنة إلى رقاقة ميكروأري ويتم تحليل النتائج باستخدام طريقتين التكميلية، طريقة معدل اكتشاف كاذبة، وباستخدام أسلوب الرواية استنادا إلى المعلومات المتبادلة وvisualiزد على الخادم على شبكة الإنترنت Retinobase 7،8.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم وضع إجراءات لاستعادة الأنسجة من كتلة الجراحية الأساسية لتحليل Transcriptome على انفصال الشبكية. ينبغي للمرء أن تلاحظ أن هذا النوع من الجراحة يمارس في حالات الطوارئ وأن أطباء العيون التشغيل لديك القليل من الوقت للمشاركة في برنامج الأبحاث البيولوجية عندما تعمل. يتم ت…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ساشا رايخمان ودومينيك Santiard-البارون لمساعدتهم في تحرير بروتوكول تنقية الحمض النووي الريبي.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referências
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Bioquímica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
