Транскриптомных анализ человеческой сетчатки Хирургические образцы Использование Журнала
Summary
Мы использовали образцы из сетчатки retinectomy для анализа транскриптомных отслойки сетчатки. Мы разработали процедуру, позволяющую РНК сохранения между хирургических блоков и лаборатории. Мы стандартизированный протокол для очистки РНК с помощью ультрацентрифугирования цезий хлорида чтобы гарантировать, что очищенный РНК пригодны для анализа микрочипов.
Abstract
Отслойка сетчатки (RD) описывает разделение нейросенсорной сетчатки от пигментного эпителия сетчатки (RPE). НПП имеет важное значение для нормальной функции светочувствительных нейронов, фоторецепторов. Отряд сетчатку от НПП создает физический разрыв, который заполняется внеклеточной жидкости. RD инициирует клеточные и молекулярные неблагоприятных событий, которые влияют как на нейросенсорной сетчатки и ПЭС, так как физиологические обмена ионов и метаболитов резко нарушается. Следствием для зрения связана с длительностью отряда с быстрым reapposition из двух тканей приводит к восстановлению зрения 1. Лечение RD исключительно хирургическое. Удаление стекловидного тела (витрэктомия) сопровождается удалением несущественных часть сетчатки вокруг удаленные районы и в пользу отслойки сетчатки. Удалены сетчатки образцы ничейная вещь (ничего) и, следовательно, обычно уничтожается.Для восстановления РНК из этих хирургических образцах, мы разработали процедуру журнал, который позволяет РНК сохранение во время передачи из хирургического блока в лабораторию. Мы также стандартизированный протокол для очистки РНК цезием ультрацентрифугирование хлорида чтобы гарантировать, что очищенная РНК подходят для глобального анализа экспрессии генов. Качество РНК была подтверждена как ОТ-ПЦР и анализ микрочипов. Анализ полученных данных показывает одновременное участие воспаления и дегенерацию фоторецепторов в течение RD.
Introduction
Основной терапевтической цели в отслойка сетчатки (RD), чтобы найти способ ограничить фоторецептора повреждения клеток и воспаление сетчатки в результате разделения фоторецепторов от сетчатки пигментированных эпителиальных клеток. Во RD, RPE клетки активируются, мигрируют, дедифференцироваться и размножаться на поверхности отслоение сетчатки, оказывая сократительной силы приводит к осложнениям. Транскриптомика анализ RD является способом для выявления целевых генов с измененной экспрессии после RD и, следовательно, будущих терапевтических молекул, которые могли бы улучшить конечный визуальный результат в сочетании с хирургией. Хорошо известно, рибонуклеиновая кислота (РНК) не является стабильным как дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), последнее время широко используется для генетических исследований, его устойчивость разрешил секвенирование генома неандертальца от палеонтологических образцов более чем 30 000 лет 2. Транскрипции ДНК генов из генома в РНК являетсяосновным процессом в экспрессии генов и мРНК лабилен для того, чтобы представлять собой сигнала. РНК очень быстро разрушается ферментами, которые заканчиваются РНКазы сигнала. Когда ткань выделяют из организма, РНК очень часто деградированных перед выражением изучается в научно-исследовательской лаборатории. Деградированных РНК не подходит для анализа экспрессии генов. Потому что сотрудники лаборатории не могут участвовать в операции, мы разработали процедуру, которая легко и требует лишь, что хирург для восстановления тканей в соответствующих РНКазы решение. РНК из тканей является стабильным и может быть проанализирована без каких-либо признаков деградации после 72 ч при комнатной температуре в этом растворе. РНК из образцов очищали с помощью стандартного метода с участием ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия после того, как были переданы в лаборатории 3. Затем качества РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле и ОТ-ПЦР. Протокол очистки РНК имеетПреимущество разделения молекул в зависимости от их плотности, которая отличается для ДНК и РНК, и гарантирует, что РНК не загрязняется молекулы ДНК, которые будут генерировать искусственной сигналов в исследования экспрессии генов. Кроме того, передача РНК (тРНК), который количественно наиболее распространенным РНК в клетке, отделены соответствии с теми же физическими свойствами из рибосомной РНК (рРНК) и матричными РНК (мРНК), эти два последних из которых конечного продукта процесса очистки. Удаление тРНК из препарата полезно, так как большинство микрочипов протоколов аналитический связано с использованием обратной транскриптазы и РНК-полимеразы, которые ингибируется тРНК 4-6. Очищенные РНК из хирургических образцов помечены с использованием стандартного протокола и гибридизовали с микроструктурного чипа, а результаты анализировали с помощью двух дополнительных методов, ложный способ скорость открытия, и с использованием нового метода, основанного на взаимной информации и визуализациюЮНЕСКО нашла на веб-сервере Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Развитие процедуру ткани восстановление после хирургического блока была необходима для транскриптом анализа отслойки сетчатки. Следует заметить, что такого рода операции практикуется в чрезвычайной ситуации и о том, что операционная офтальмологи имеют мало времени для участия в про…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сашу Райхман и Доминик Santiard-барона за помощь в редактировании протокола очистки РНК.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referências
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Bioquímica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
