Transkriptom-Analyse der menschlichen Retina chirurgischen Proben mit Journal
Summary
Wir verwendeten Retina Proben aus Retinektomie für eine Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Wir entwickelten ein Verfahren, das RNA Konservierung zwischen den chirurgischen Blöcke und Labor ermöglicht. Wir standardisierten ein Protokoll zur RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für Microarray-Analyse sind zu reinigen.
Abstract
Netzhautablösung (RD) beschreibt eine Trennung der Neuroretina aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Das RPE ist wichtig für die normale Funktion der lichtempfindlichen Nervenzellen, die Photorezeptoren. Ablösung der Netzhaut von der RPE schafft eine physische Lücke, die mit extrazellulären Flüssigkeit gefüllt ist. RD initiiert zellulären und molekularen unerwünschten Ereignisse, die sowohl die Neuroretina und die RPE da die physiologischen Austausch von Ionen und Metaboliten stark gestört wird beeinflussen. Die Folge für das Sehen ist auf die Dauer der Abteilung seit einer schnellen reapposition der beiden Geweben führt zur Wiederherstellung des Sehens 1 verbunden. Die Behandlung von RD ist ausschließlich chirurgisch. Entfernen des Glaskörpers (Vitrektomie) wird durch die Entfernung nicht wesentlicher Teil der Netzhaut um die freistehende Fläche zu Netzhautablösung begünstigen gefolgt. Die entnommenen Proben sind retinale res nullius (nichts) und damit in der Regel verworfen.Um RNA aus diesen chirurgischen Proben zu erholen, haben wir das Verfahren Journal, dass RNA Erhaltung ermöglicht während der Übertragung aus dem OP-Block an das Labor. Wir haben auch ein Protokoll zur standardisierten RNA durch Caesiumchlorid Ultrazentrifugation zu reinigen, um sicherzustellen, dass die gereinigten RNAs geeignet für globale Genexpressionsanalyse sind. Die Qualität der RNA wurde sowohl durch RT-PCR und Microarray-Analyse bestätigt. Die Analyse der Daten zeigt eine gleichzeitige Einbeziehung der Entzündung und Photorezeptordegeneration während RD.
Introduction
Die wichtigste therapeutische Ziel in Netzhautablösung (RD) ist, einen Weg zu Photorezeptor Zellschäden und Netzhautentzündungen aus der Abtrennung von den Photorezeptoren der retinalen pigmentierten Epithelzellen begrenzen finden. Während RD, sind RPE-Zellen aktiviert, wandern, dedifferenzieren, und vermehren sich an der Oberfläche der abgelösten Netzhaut ausübt kontraktilen Kräfte führt zu Komplikationen. Transcriptomics Analyse der RD ist ein Weg, um Zielgene mit modifizierten Ausdruck identifizieren nach RD und damit zukünftige therapeutische Moleküle, die endgültige visuelle Ergebnis in Kombination mit Chirurgie verbessern könnte. Es ist bekannt, Ribonukleinsäure (RNA) ist nicht stabil wie Desoxyribonukleinsäure (DNA), wobei letztere ausgiebig für genetische Studien verwendet wird, hatte seine Stabilität die Sequenzierung des Neandertaler-Genoms von paläontologischen Proben von mehr als 30.000 Jahre alt 2 zulässig. Die Transkription der DNA der Gene aus dem Genom in Boten-RNA istHauptprozess in der Genexpression und der mRNA ist, um ein Signal zu bilden labil. RNAs sind sehr schnell durch RNAse Enzyme, die das Signal zu beenden. Wenn Gewebe aus einem Organismus isoliert werden, sind die RNAs sehr oft abgebaut, bevor der Ausdruck in einem Forschungslabor untersucht wird. Gestörter RNA ist nicht für die Analyse der Genexpression geeignet. Da das Laborpersonal nicht in der Chirurgie zu beteiligen, wurde ein Verfahren entwickelt, das einfach und erfordert lediglich, dass der Chirurg das Gewebe in eine geeignete RNAse-freie Lösung zu erholen. Die RNA aus den Geweben ist stabil und kann ohne Anzeichen von Abbau nach 72 Stunden bei Raumtemperatur in dieser Lösung analysiert werden. Die RNAs von Proben werden durch ein standardisiertes Verfahren, das eine Ultrazentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten nachdem das Labor 3 übertragen wurden gereinigt. Dann werden die Qualität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese und mittels RT-PCR untersucht. Die RNA Aufreinigung Protokoll hat dieVorteil der Trennung der Moleküle nach ihrer Dichte, die sich für die DNA und RNA ist und gewährleistet, dass die RNA nicht durch eine DNA-Moleküle, die Artefakt-Signale in Genexpressionsstudien erzeugen verunreinigt. Darüber hinaus werden die Transfer-RNAs (tRNAs), die quantitativ sind die häufigsten RNA in einer Zelle gemäß der gleichen physikalischen Eigenschaft aus der ribosomalen RNA (rRNA) und die Messenger-RNA (mRNA), die beiden zuletzt die das abgetrennte Endprodukt des Reinigungsprozesses. Die Entfernung der tRNA aus der Herstellung ist nützlich, da die meisten der Mikroarray Analyseprotokollen bei dem durch Verwendung von Reverse Transkriptase und RNA-Polymerasen, die von tRNA 4-6 gehemmt werden. Die gereinigte RNA von chirurgischen Proben markiert sind unter Verwendung des Standardprotokolls und hybridisiert mit einem Microarray-Chip und die Ergebnisse wurden mit zwei komplementären Verfahren der False Discovery-Verfahren und unter Verwendung eines neuartigen Verfahrens zur gegenseitigen Information und Visualisierung basierendzed auf der web-basierten Server Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewebe Erholung von der OP-Block ist wesentlich für die Transkriptom-Analyse der Netzhautablösung. Man sollte beachten, dass diese Art der Operation in Not und die Augenärzte Betriebssystem haben wenig Zeit, um in einer biologischen Forschungsprogramm teilnehmen, wenn sie tätig wird geübt. Diese Retinektomie auch stochastisch in jeden Dienst durchgeführt, so dass der einfachere Weg zu statistischen Zahlen erreichen, mit einem Netzwerk zu arbeiten. In einem solchen Netzwerk ist …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sacha Reichmann und Dominique Santiard-Baron für ihre Hilfe bei der Bearbeitung der RNA Aufreinigung Protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referências
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