Transkriptom analyse af menneskets retinale kirurgiske prøver vha. Journal
Summary
Vi brugte retina prøver fra retinectomy for en transkriptom analyse af nethindeløsning. Vi udviklede en procedure, der gør det muligt for RNA bevaring mellem de kirurgiske blokke og laboratoriet. Vi standardiseret en protokol til oprensning af RNA ved cæsiumchlorid-ultracentrifugering at sikre, at de oprensede RNA'er er egnet til microarray analyse.
Abstract
Nethindeløsning (RD) beskriver en adskillelse af den neurosensoriske nethinde fra den retinale pigmenterede epithelium (RPE). RPE er afgørende for en normal funktion af de lysfølsomme neuroner, de fotoreceptorer. Nethindeløsning fra RPE skaber en fysisk hul, der er fyldt med ekstracellulære væske. RD indleder cellulære og molekylære hændelser, der påvirker både neurosensoriske nethinden og RPE siden fysiologiske udveksling af ioner og metabolitter er alvorligt foruroliget. Konsekvensen for vision er relateret til varigheden af løsrivelse da en hurtig reapposition af de to væv resulterer i genoprettelsen af synet 1.. Behandlingen af RD er udelukkende kirurgisk. Fjernelse af glasagtige gel (vitrektomi) efterfølges af fjernelse ikke væsentlig del af nethinden omkring den fritliggende område at favorisere nethindeløsning. De fjernede retinale eksemplarer er res nullius (intet) og dermed normalt kasseres.At inddrive RNA fra disse kirurgiske prøver vi udviklet procedure tidsskrift, der tillader RNA bevaring under overførslen fra den kirurgiske blok til laboratoriet. Vi har også standardiseret en protokol til oprensning af RNA ved cæsiumchlorid-ultracentrifugering at sikre, at de oprensede RNA'er er egnede til globale genekspression analyse. Kvaliteten af RNA blev valideret både ved RT-PCR og microarray analyse. Analyse af data viser en simultan inddragelse af inflammation og fotoreceptordegenerering løbet RD.
Introduction
Det vigtigste terapeutiske mål i nethindeløsning (RD) er at finde en måde at begrænse fotoreceptor celleskader og retinal inflammation som følge af adskillelsen af fotoreceptorer fra retinale pigmenterede epitelceller. Under RD, er RPE celler aktiveres, migrere, dedifferentiate og formere ved overfladen af den fritliggende nethinden, udøve kontraktile kræfter fører til komplikationer. Transcriptomics analyse af RD er en måde at identificere target gener med ændret udtryk efter RD og dermed de fremtidige terapeutiske molekyler, der kunne forbedre den endelige visuelle resultat i kombination med kirurgi. Det er velkendt ribonucleinsyre (RNA) er ikke stabil som er deoxyribonukleinsyre (DNA), sidstnævnte bliver brugt i vid udstrækning til genetiske undersøgelser, havde dens stabilitet tilladt sekventering af Neanderthal genom fra palæontologiske prøver af mere end 30.000 år gammel 2.. Transkription af DNA af generne fra genomet i messenger-RNA erstørre proces genekspression og mRNA er labil for at udgøre et signal. RNA'er er meget hurtigt nedbrudt af RNAse enzymer, der udtræden signalet. Når væv er isoleret fra en organisme, de RNA er meget ofte nedbrydes, før udtrykket er undersøgt i et forskningslaboratorium. Uregelmæssig RNA er ikke egnet til analyse genekspression. Fordi laboratoriet personale ikke kan deltage i kirurgi, vi udviklet en procedure, der er let og kræver kun, at kirurgen til at inddrive væv i en passende RNAse-fri opløsning. RNA fra vævene er stabil og kan analyseres uden nogen tegn på nedbrydning efter 72 timer ved stuetemperatur i denne opløsning. RNA'erne fra prøver oprenses ved en standardiseret fremgangsmåde der involverer en ultracentrifugering på en cæsiumchloridgradient efter at være blevet overført til laboratoriet 3.. Derefter er kvaliteten af RNA'erne vurderes ved agarosegelelektroforese og med RT-PCR. RNA oprensningsprotokol harfordel at adskille molekylerne i henhold til deres densitet, der er forskellig for DNA og RNA, og sikrer, at RNA ikke er forurenet med et DNA-molekyler, der vil generere kunstig signaler i genekspressionsstudier. Desuden er de transfer RNA'er (tRNA'er), som er kvantitativt mest rigelige RNA inden for en celle, adskilles efter samme fysiske egenskab fra det ribosomale RNA (rRNA), og messenger RNA (mRNA), de to sidste er de slutprodukt af rensningsprocessen. Fjernelsen af tRNA fra præparatet er nyttigt, da de fleste af microarray analysemetoderne indebar brug af reverse transkriptase og RNA polymeraser, der inhiberes af tRNA 4-6. De rensede RNA fra kirurgiske prøver er mærket ved hjælp af standard protokol og hybridiseret til en microarray chip, og resultaterne analyseres ved hjælp af to komplementære metoder, den falske opdagelse sats metode, og ved hjælp af en ny metode baseret på gensidig information og visualiseringzed på webbaserede server Retinobase 7,8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Udviklingen af en procedure for væv opsving fra den kirurgiske blok har været afgørende for den transkriptomet analyse af nethindeløsning. Man bør bemærke, at denne type kirurgi praktiseres i en nødsituation, og at øjenlæger opererer har lidt tid til at deltage i et biologisk forskningsprogram, når de opererer. Denne retinectomy er også udført stokastisk i hver tjeneste, således at den nemmere måde at nå statistiske tal er at arbejde med et netværk. I dette netværk, er standardiseringen af v…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Sacha Reichman og Dominique Santiard-Baron for deres hjælp med at redigere RNA oprensningsprotokol.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
Referências
- Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).
- Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710 (2010).
- Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Bioquímica. 13 (12), 2633 (1974).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).
- Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).
- Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).
- Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).
- Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208 (2008).
- Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).
