Summary
In diesem Video zeigen wir Ihnen, Modifikation Techniken für poröse metallische Implantate, um ihre Funktionalität zu verbessern und die Zellwanderung steuern. Techniken umfassen die Entwicklung von Poren Gradienten zu Zelle Bewegung in 3D und Produktion von Basalmembran imitiert zu Zelle Bewegung in 2-D zu steuern. Auch ist eine HPLC-Methode zur Überwachung Implantatintegration in-vivo durch eine Analyse von Blut Proteine beschrieben.
Abstract
Metallic Implantaten, insbesondere Titan-Implantate, sind weit verbreitet in klinischen Anwendungen eingesetzt. Tissue in-Wachstum und Integration dieser Implantate im Gewebe sind wichtige Parameter für eine erfolgreiche klinische Ergebnisse. Um Gewebe Integration zu verbessern, haben poröse metallische Implantate entwickelt. Offene Porosität von metallischen Schäumen ist sehr vorteilhaft, da die Poren Bereiche, ohne die mechanischen Eigenschaften der ganzen Struktur funktionalisiert werden können. Hier beschreiben wir solche Modifikationen mit porösem Titan-Implantate auf Titan Mikrokügelchen basiert. Durch die Verwendung von inhärenten physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie von Titan, ist es möglich, hydrophoben Poren Gradienten innerhalb Mikrokügelchen auf metallischen Implantaten und zur gleichen Zeit zu erhalten, müssen eine Basalmembran an hydrophilen, natürlichen Polymeren imitieren basiert. 3D Poren Gradienten werden durch synthetische Polymere, wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) durch Gefriertrocknen Extraktionsverfahren gebildet wird. 2D Nanofibrill surFlächen mit Kollagen / Alginat durch einen Vernetzungsschritt mit einem natürlichen Vernetzer (genipin) gefolgt ist. Diese Nanofasern Folie wurde um Schicht (LbL)-Abscheidungsverfahren der beiden entgegengesetzt geladenen Molekülen, Kollagen und Alginat aufgebaut. Schließlich ein Implantat, wo verschiedene Bereiche verschiedene Zelltypen aufnehmen kann, als dies erforderlich ist für viele vielzelligen Geweben, erhalten werden. Durch kann auf diese Weise zelluläre Bewegung in verschiedenen Richtungen von unterschiedlichen Zelltypen gesteuert werden. Ein solches System ist für den speziellen Fall der Luftröhre Regeneration beschrieben, aber es kann auch für andere Zielorgane modifiziert werden. Analyse der Zellwanderung und die möglichen Methoden für die Erstellung von verschiedenen Pore Gradienten werden erarbeitet. Der nächste Schritt in der Analyse solcher Implantate ist die Charakterisierung nach der Implantation. Allerdings ist die histologische Analyse von metallischen Implantaten ein langer und mühsamer Prozess, also für Überwachungs-Host Reaktion auf metallische Implantate in vivo eine einerlternative Verfahren zur Überwachung und CGA verschiedenen Blut-Proteinen wird ebenfalls beschrieben. Diese Methoden können für die Entwicklung von in vitro maßgeschneiderte Migration und Kolonisation Tests verwendet werden und auch für die Analyse von funktionalisierten metallischen Implantaten in vivo ohne Histologie verwendet werden.
Introduction
Derzeit verfügbare metallische Implantate eignen sich für tragende Anwendungen, aber ihre nicht Abbaubarkeit erforderlich Designs, die eine starke Grenzfläche mit dem Gewebe um sie 1 sicherzustellen. Durch die Bereitstellung von Strukturen, die in zelluläre Wachstum und Kolonisierung in vivo zu erleichtern, kann die Lebensdauer der metallischen Implantaten 2 verlängert werden. Offen poröse metallische Implantate sind vielversprechende Materialien für Tissue Engineering und Schnittstelle auch für eine gute Besiedlung der Implantate. Sie wurden aktiv als orthopädische Implantate und auch als Luftröhre Implantate 3-5 verwendet. Jedoch gibt es immer noch Probleme, die wie die genaue Kontrolle über die Bewegung der Zellen in den Poren Bereiche gelöst werden müssen. Die Nichtbeachtung dieser Prozess steuern könnte zu einer unvollständigen Kolonisation in einem Ende und Restenose in der anderen führen. Auch weitere Funktionalisierung dieser Implantate ist notwendig für die Erreichung höherer Funktionen, wie die Lieferung von Wachstumsfaktoren,gerichtet Vaskularisierung und gleichzeitige Bewegung der verschiedenen Zelltypen 6-8. Für trachealen Implantate ist dies wichtig, da die Besiedlung des Implantats durch einen vaskularisierten Gewebe erwünscht ist. Jedoch ist das unkontrollierte Wachstum eines Gewebes, um das Lumen der Luftröhre unerwünscht, da sie Implantat Durchgängigkeit abnimmt.
Eine Möglichkeit zur Bewegung der Zellen steuern Größe Ausgrenzung. Durch die Kenntnis der Größe der Zielzellen und ihre Fähigkeit, mit einem bestimmten synthetischen Polymer wechselwirken kann man Gradienten von Poren, die effektiv bestimmen die Tiefe der Zelle Bewegung zu entwickeln. Zum Beispiel, indem ein Porenarchitektur, die groß genug für die Eingabe von Bindegewebszellen, wie Fibroblasten extraluminally, aber klein genug ist (weniger als 10 um), um ihre Bewegung zu verhindern intraluminally eine wirksame Kontrolle über Besiedlung einer röhrenförmigen Implantats erreicht wird.
Von Verfügung Porenerzeugung Methoden wie Gefrier-Trockenmaschng, Partikel Auslaugung, Gas Schäumen 9,10; die einfachste Methode für die schnelle Bildung von Poren Gradienten anzupassen mit minimalen notwendigen Ausrüstungen ist Gefrier-Extraktion 11. In diesem Verfahren wird ein Polymer-Lösung in einer binären Mischung eines organischen Lösungsmittels und Wasser eingefroren. Anschließend wird das Lösungsmittel durch Extraktion mit einem mischbaren vorgekühlten Flüssigkeit, wie Ethanol ausgetauscht. Einfrieren und Extraktion bestimmen die Form und Größe der Poren und wenn die Extraktion in einer Weise, wo die Bewegung der Extraktionslösung gesteuert werden kann erfolgt, Porengröße und Form kann direktional moduliert.
Zweiter Schritt für mehrzellige Gewebe ist die Bildung von porösen Schranken zwischen verschiedenen Zelltypen, um ihre Wechselwirkung zu steuern. Dies ist auch notwendig für die Verfügbarkeit der verschiedenen Mikroumgebungen für verschiedene Zelltypen je nach Bedarf 12,13. Trachea ein röhrenförmiges Organ, Kehlkopf verbindet mit Bronchi. Es verfügt über einen inneren pseudostratified Ciliarepithel Futter mit interdispergierte Becherzellen, die Schleim produzieren. Die 3D-Struktur und Stabilität der Luftröhre von Knorpel in der Form von C-Ring gehalten wird. Somit wird in einer künstlichen Luftröhre sollte eine definierte Verbindung zwischen dem Bindegewebe und dem ciliary Epithelschicht sein. Während eine 3D-Struktur ist für den Bindegewebeteil notwendig, erfordert die Migration von Epithelzellen aus Basalmembran-ähnlichen Oberfläche gerichtete Bewegung und Verschließen der Wunde zu erreichen. Polyelektrolytmultischicht Filme (PEM) sind eine mögliche Option, um Basalmembran Mimik erhalten. Schicht-für-Schicht-Verfahren (LBL) ist ein vielseitiges Verfahren zu dünn und der Beschichtung von Oberflächen zu erhalten. Es ist auf elektrostatischen Wechselwirkungen von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten und deren Aufbau in einer sequentiellen Weise basierend auf nanoskaligen Oberflächenbeschichtungen, deren Eigenschaften durch einfaches Ändern Variablen wie Polyelektrolytspezies, pH variiert werden erhalten,Schicht Nummer Zugabe einer Deckschicht, Vernetzung usw. Einer der wichtigsten Vorteile der LbL-Methode ist die Möglichkeit, an die Topographie des darunterliegenden Substrats entsprechen. Somit wird unter kontrollierten Bedingungen kann dieses Verfahren auch zur Gewinnung von Oberflächenbedeckung von porösen Strukturen verwendet werden. Wenn Kollagen als einer der Polyelektrolyte ist es möglich, Nanofibrill Strukturen, die die Oberfläche der Basalmembran erhalten nachahmen kann. Die Hydrophobie von Titan ermöglicht die Entwicklung solcher Strukturen und fibrillarity können in dicken Schichten 14 beibehalten werden. Auf diese Weise Befestigung und Bewegung der Zelle auf der Oberfläche gesteuert werden. Durch die Verwendung von Gefrier-Extraktion und LbL Filmbeschichtung sequentiell kann eine Struktur, bei der Zellbewegung seitlich gesteuert werden kann, in Längsrichtung und in Umfangsrichtung 15 erhalten werden.
Hier beschreiben wir zwei neue Methoden zur Modifikation Titan-Implantate mit ihrer hydrophoben Verhalten, das kannerweitert Modifikation verschiedene poröse Implantate: i) Bildung von Gradienten von Mikroporen in den makroporösen Titan-Implantate mit hydrophoben, synthetischen Polymeren, ii) Bildung einer dicken polymeren Filmschicht auf der Implantatoberfläche, die Zellwachstum und Futter Bildung von Polyelektrolyt unterstützt. Diese Verfahren können sequentiell oder separat verwendet werden. Sie bieten Strukturen, die kontrollierte Migration und räumliche Organisation der verschiedenen Zelltypen in vielzelligen Geweben 16,17 gewährleisten. Für den speziellen Fall der Luftröhre, würde das gewünschte Ergebnis für das Implantat die Kolonisation durch fibrovascular Gewebe innerhalb der Mikroporen Gradienten ohne Restenose und der Bildung der inneren Auskleidung Flimmerepithelzellen auf den Polyelektrolyt.
Eine Möglichkeit zur Kontrolle Integration der Implantate ist es, kleine chirurgische Eingriffe während der die Integration mit dem Host in situ zu tun. Um in der Lage t werdeno entscheiden über den Zeitpunkt der Interventionen, ist es wichtig, Informationen über die systemischen Wirkungen des Implantats haben. C-reaktives Protein (CRP) ist für die Überwachung von Infektionen und entzündlichen Reaktion in klinischen Umgebungen verwendet. Chromogranin A (CGA) können in ähnlicher Weise verwendet werden könnten und genauere Ergebnisse zu liefern, um das Niveau der Entzündung 18 zu beobachten. Als einen möglichen Weg der Beobachtung metallischen Implantat Integration in vivo, präsentieren wir ein kontinuierliches Monitoring-Verfahren des Implantats systemische Effekte durch Charakterisierung von tierischen Blutproben mit Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) und anschließender Protein-Sequenzierung. Ausarbeitung dieser Methode kann verwendet werden, um regelmäßige Endpunkt histologische Analyse entziehen werden. Histologische Schneiden von metallischen Implantaten ist ein langer, umständlich und teuer und kann nur zu bestimmten Zeitpunkten durchgeführt werden. Aus diesem Grund, Bluttests Bereitstellung robuster Informationen über das Implantat Gesundheit gut gestaltete würdemöglich sein, Wege zu Tierversuchen zu verringern, wie durch die jüngsten EU-Vorschriften über Tierversuche vorgeschrieben.
Die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um die Leistung von metallischen Implantaten durch Funktionalisierung zu verbessern oder um einen alternativen Weg zum Überwachen der vorhandenen Implantate werden.
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Protocol
1. Herstellung von Micropore Farbverläufe in Makroporöse metallischen Implantaten
- Reinigen der Implantate (z. B. Implantaten aus medizinischem Titan Perlen mit einem Größenbereich von 400-500 um, Neyco SAS, Frankreich hergestellt) mit Ethanol und dann beschallt in Aceton für 15 min.
- Entwurf und Herstellung Teflonformen nach dem Implantat Größe und Form (Standardfunktionen Experimente, zylindrische Formen von 1,5 cm Durchmesser mit einer Höhe von 2 cm verwendet werden). Formen sollte modular, so dass die bestimmten Teile während der Extraktion entfernt werden. Eine solche Form Design sorgt für die Steuerung der Extraktion durch Erzwingen der Bewegung der Extraktionsflüssigkeit in einer gerichteten Art und Weise.
- I) einen unteren Teil, um die Größe des Implantats zu bestimmen ii) ein Dorn und iii) einen äußeren Kern, der abnehmbar ist: für röhrenförmige Implantate zur Luftröhre zu ersetzen, sollte die Struktur aus drei Teilen zusammengesetzt sein. Auf diese Weise kann die Porengröße Gradienten von außen nach innen gebildet werden. <li> Vorbereiten des synthetischen Polymer (PLLA)-Lösung: Für die Gefrier / Extraktion PLLA Lösung in einer binären Mischung aus Dioxan und Wasser (: v 87:13%, v) hergestellt werden muss.
- Das Gemisch wird auf 60 ° C, um eine homogene Lösung zu erhalten. 60 ° C ausgewählt, da es die obere Grenze der Temperatur Widerstand für die KPG-Spritzen, die für die Einführung der Lösung in die Implantate verwendet werden muss, ist.
- Wenn eine hohe Konzentration (≥ 6%), mit hohem Molekulargewicht PLLA-Lösungen verwendet werden, stellen die Lösung in das Implantat sofort nach dem Erhitzen. Ansonsten Gelierung der Lösung erfolgt ohne vollständige Eintauchen.
- Berechnen des Volumens des erforderlichen Polymerlösung in Bezug auf die Porosität des Implantats kann die Genauigkeit Änderung in dem Volumen des gefrorenen Lösung in Betracht gezogen werden.
- Führen Sie die Lösung in die Implantate mit KPG-Spritzen mit 0,1 ul Genauigkeit. Die untere Grenze für die Polymerkonzentration3% für reproduzierbare Porengradient Bildung Erwägung, dass es hart wird, um eine homogene Verteilung in den dicken Proben über 6% zu erhalten. Für bestimmte Anwendungen andere Konzentrationen verwendet werden.
- Einfrieren der Proben entweder direkt bei -80 ° C oder mit einem vor Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur. Einfrieren zu bestimmen teilweise die Bildung von Poren, so dass die Frost kann entsprechend der Porosität soll eingestellt werden. Halten Sie die Proben über Nacht bei -80 ° C
- Extraction: Tauchen Sie die Implantate in 80% EtOH vorgekühlt. Führen Sie die Extraktion bei -20 ° C über Nacht. Um Porositätsgradienten zu erhalten, entfernen Sie alle Formteile mit Ausnahme des Dorns für die röhrenförmigen Implantate und alle Teile mit Ausnahme der untere Teil für scheibenförmige Implantate. Verwenden Sie einen vorgekühlten Skalpell zum leichteren Abtrennen der Form.
- Nach der Extraktion bei -20 ° C über Nacht 19, entfernen Sie die restlichen Formteile und Luft trocknen die Implantate. Zur Charakterisierungdie Gesamtporosität der Struktur Quecksilberporosimeters Analyse notwendig. Quecksilberporosimeters Messungen zeigten deutliche Spitzen, die die Poren an den beiden Seiten des Implantats und die kleineren Poren interdispergierte entsprechen. Doch die wichtigere Daten ist der Unterschied zwischen den Porositäten intraluminale extraluminalen und Oberflächen, die durch Bild-J für die Porengrößenverteilung mit einem Rasterelektronenmikroskop (SEM) 20 analysiert werden kann. Zur Überprüfung der Porengradient, Gefrierbruch die Proben und beobachten Sie den Querschnitt mit SEM.
- Durch die offene poröse Natur der Implantate verwendet, und der Licht reflektierenden Kapazität von Titan, ist es möglich, z-Stapel von markierten Zellen in den porösen Implantate. Beschriften Sie die Zellen mit PKH26 oder Calcein-AM und visualisieren die Implantate mit der konfokalen Laser-Mikroskopie.
2. Oberflächenbeschichtung poröse metallische Implantate mit Kollagen / Alginat Multilayers
- Für Aufbauvon Multilayer wird höchste Reproduzierbarkeit mit Dip Roboter erhalten. Wenn jedoch ein Eintauchen Roboter nicht in diesen Schritten kann manuell erfolgen.
- Verwenden medical grade Kollagen Typ I und Natriumalginat. Die optimierten Konzentrationen liegen bei 0,5 g / L für jede in 150 mM NaCl in Citratpuffer bei pH 3,8.
- Man löst das Kollagen Lösung über Nacht, um die Homogenität der Lösung zu gewährleisten. Sauren pH-Wert von 3,8 ist für einen stabilen Aufbau der Schichten die Struktur instabil vor der Vernetzung in neutralen pH ist.
- Zahlen Sie die Schichten durch ein Eintauchen Robotersystem durch Eintauchen der Implantate in Kollagen und Alginatlösungen alternativ. Deposition beträgt 15 min für jede nachfolgende Schicht. Spülen Sie die Struktur zwischen Abscheidungsschritte mit 150 mM NaCl bei pH 3,8 für 5 min.
- Design-spezifischen Halter für den Einsatz der Implantate mit dem Eintauchen in Roboter Polyelektrolytmultischicht Produktion verwendet. Zahlen Sie die Schichten auf der Oberfläche entweder Titan nur IMPLAngen oder Implantate modifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
- Die Stabilisierung der Basalmembran imitieren mit Genipin: Vorbereiten der vernetzenden Lösung in einem Dimethylsulfoxid (DMSO) / Citrat-Puffer (150 mM NaCl, pH 3.8) bei 01.04 v: v-Verhältnis. Ein breiter Bereich von Konzentrationen verwendet werden kann und 100 mM ist ausreichend für die Vernetzung. Auflösen Genipin erste in der DMSO Komponente und fügt die Komponente Wasser später zu vermeiden verklumpen.
- Vernetzung der Proben durch das Eintauchen in die Vernetzung Lösung zwischen 12-24 Stunden. Anschließend mit reichlich Citratpuffer (pH 3,8) zu spülen.
- Nach dem Waschen Schritte, sterilisieren die Proben entweder mit UV-Behandlung (30 min) oder einem Antibiotikum / Antimykotikum Bad (Penicillin / Streptomycin, Fungizone).
- Die wichtigsten Parameter, die die Qualität der Basalmembran imitieren bestimmen die Dicke und der Durchmesser der Fasern. Berechnen Sie die Faserdurchmessern mit Atomic Force Microscopy (AFM)-Bilder in Kontakt-Modus erhalten. Trocknen Sie die Proben mit einemStickstoff-Flow vor Bildgebung. Quantifizierung der Dicke von mindestens 10 Fasern pro Bild, um die durchschnittliche Dicke Fibrillen mit Bild J Software zu bestimmen.
- Die Dicke der Folien kann durch Kratzversuche mit AFM bestimmt werden. Dry (COL / ALG) 24 / COL mehrschichtigen Folien. Verwenden Sie eine Spritze und Nadel, um den Film zu kratzen. Nach Lokalisierung der Kratzer mit einem Lichtmikroskop, erhalten Bilder mit AFM auf 10 x 10 um 2 Flächen an der Grenze von der Pike auf. Berechnen der Höhe der Profile mit dem AFM-Software, die die Dicke der Filmschicht erhalten wird.
3. Indirekte Überwachung von Implant Integration von In-vivo-Analyse von Blut-Plasma
- Alle notwendigen Genehmigungen sollten Ausschuss für Tierversuche nach den Regeln über für jedes Land 21 entnommen werden. In unserem Fall ist der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Research Council, 2010) folgt und the-Zulassung von der Universität Straßburg Ethikkommission erhalten.
- Führen Sie die Implantation am Zielort. Das Blut Überwachung Protokoll gegeben wurde hier für Tracheal Ersatz in weißen Neuseeland-Kaninchen aus einem 15 mm Trachea Resektion eingesetzt.
- Nach Implantation eine tägliche Follow-up ist notwendig, wie montioring das allgemeine Wohlbefinden der Tiere (Heilung um die OP-Websites, Atemfrequenz) und die Aufnahme ihres Gewichts.
- Um den Bluttest prüfen, kann ein gut etabliertes Verfahren, wie ELISA Tests für Blut CRP-Werte. CRP Tests für viele Tiere zur Verfügung stehen und die speziellen für Kaninchen ist in Tabelle 1 aufgeführt. In ähnlicher Weise verwenden Western Blot zur Bestimmung der CGA Ebenen. Monoklonale Antikörper anti-CGA (anti-CGA 47-68) wurden in diesem Protokoll verwendet.
- Für Plasma-Charakterisierung, erhalten Blutproben der Ohrmuschel Venen der Kaninchen. Zentrifugieren bei 5000 rpm für 20 min bei 4 °; C. Verwenden Sie den Überstand zur Analyse erhalten. In unserem Verfahren werden diese Tests auf einer wöchentlichen Basis getan, aber häufigere Tests sind ebenfalls möglich.
- Reverse-Phase HPLC-Reinigung des Plasma-Protein-Gehalt: Entpacken Sie die Kaninchen Plasma mit 0,1% Trifluoressigsäure (1:1, v: v). Reinigen des Extrakts mit einem Dionex HPLC-System (Ultimate 3000; Sunnyvale, CA USA) auf einem Reverse-Phase Nucleosil 300-5C18-Säule (4 x 250 mm; Partikelgröße 5 um; Porosität 300 Å).
- Notieren Sie sich die Absorption bei 214 und 280 nm. Als Lösemittelsystem ist i) Lösungsmittel A: 0,1% (v / v) Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser und ii) Lösungsmittel B: 0,09% (v / v) TFA in 70% (v / v) Acetonitril-Wasser.
- Verwenden Sie einen Volumenstrom von 700 ml / min mit Gradienten für Elutionen. Sammeln Sie die Peak-Fraktionen. Konzentrieren sich die Fraktionen durch Verdampfen von speed-Vakuum-Anwendung. Es ist wichtig, um die Geschwindigkeit zu-Vakuum vor der vollständigen Trockne stoppen.
- Korrelieren die Peaks bei verschiedenen Zeitpunkten über die Zusammenarbeit erhaltenUrse der Implantation Zeitraum. Verwenden der gereinigten Peptide, die sich konsequent Trends im Verlauf der Implantation für die Identifizierung durch automatische Edman-Sequenzierung.
- Automatische Edman-Sequenzierung der Peptide: Bestimmen der N-terminale Sequenz der gereinigten Peptide automatischen Edman-Abbau unter Verwendung eines Procise Mikrosequenzers. Legen Sie die Probe auf Polybrene behandelten Glasfaser-Filter. Der nächste Schritt ist die Ermittlung der Phenylthiohydantoin-Aminosäuren (Pth-Xaa) durch Chromatographie an einer C18-Säule (PTH C-18, 2,1 x 200 mm) 22. Nach der Sequenz erhalten wird, kann es von Blast-Software mit der Swiss-Prot-Datenbank identifiziert werden.
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Representative Results
Bildung von Poren Gradienten
Durch die Änderung der Konzentration des PLLA Lösung ist es möglich, die Größe der Poren auf der extraluminalen Seite der Implantate zu steuern. Porengröße und Form wurde durch die Anwesenheit von Titan-Implantaten (Abbildungen 1a und 1b) betroffen. Porengrößen reichten von 40 bis 100 um und Nutzung von niedrigeren Konzentrationen führten zu kleineren Poren. Während in der intraluminalen Seite Porengröße wurde durch die eingeschränkte Extraktion regiert und war um 9 um 23, weniger als die durchschnittliche Größe von Fibroblasten. Durch Zugabe eines Inkubationsschritt bei Raumtemperatur eine doppelte poröse Struktur, wobei die Porenwände der größeren Poren eigene Porosität erhalten werden kann. Diese Funktion ist wichtig für dicke Implantate, da sie die Gas-und Nährstoff-Bewegung (Abbildung 1c) erleichtern würde.
Nanofibrill Basalmembran-mimische Bildung
(Abbildung 2) hinzufügen. Diese Filmschicht ist stabil auf dem PLLA-Schaum, und es kann auch auf der Oberfläche in der Abwesenheit von dem Schaum (3a und 3b) gehalten werden. Nanoscale Kollagenfasern bilden, wie der Film Schicht wächst (Abbildung 3c). Das Wachstum der Schicht exponentiell, wodurch ein dicker Film von einigen hundert Nanometern erhalten werden (Abbildung 3d) werden.
Analyse von Blutplasma mit HPLC und anschließende Sequenzierung nach der Implantation
Poröse Titan-Implantate mit Wirtsgewebe integriert und vollständig zwischen 4-6 Wochen in vivo (Abbildung 4) gefüllt ist. Allerdings kann Fortsetzung dieses Prozesses zu einer Restenose führen und in Gegenwart des Porengradient aufgrund der PLLA Struktur, keine Fibroblasten Anwesenheit die beobachtetfter von 6 Wochen nach Implantation 20. Während dieser Zeit HPLC-Analyse zeigte deutliche Spitzen, die während des Zeitverlaufs der Implantation schwanken. Die Peak-Fraktionen von Interesse sind sequenziert und entschlossen, alpha-und beta-Hämoglobin ½ Ketten (Abbildung 5), die einen ähnlichen Trend mit CRP Lesungen gezeigt hatte.
Abbildung 1. Methode der Porengradient Bildung. Herstellung von porösen PLLA Schäume über Gefrier-Extraktionsverfahren. REM-Aufnahmen (A) ohne makroporösen Titan-Implantate (außen) (B) mit makroporösen Titan-Implantate (außen) (C) mit makroporösen Titan-Implantate (innere). Das Vorhandensein der Implantate verändert die Porenmorphologie. (C, D) gleiche Verfahren kann Appl ied zu röhrenförmigen Strukturen Pore Gradienten in röhrenförmigen Implantate zu erhalten. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Schema des multifunktionalen Implantatentwicklung. Ausgehend von Mikrokügelchen basierende poröse Implantate, durch Zugabe eines synthetischen Polymeren Schaum eine Porengröße Gradienten erhalten werden. Die Form des Porengradient teilweise durch die Struktur der Formen kontrolliert wird. Am Anfang der Struktur einer Basalmembran-Struktur hinzugefügt werden können, was eine geeignete Oberfläche für die Zellanheftung und Futter Bildung in 2D stellen.
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Abbildung 3. Nanofibrill Multilayer Bildung auf Titan-Implantate als Basalmembran mimick. Thick Kollagen / Alginat-Multischichten gezielt auf der Oberfläche (A) Titan nur Implantaten (mit einer mittleren Perlengröße von 400-500 um) (B) Titan / PLLA Schaum gebildeten Hybride werden. Diese Fläche (~ 1 um dick) ein Substrat für die Befestigung und die Proliferation der Endothelzellen (C) Das Nanofibrill Art der Multischichten durch AFM-Analyse (Scan-Bereich: 30 um x 30 um) gekennzeichnet (D) Dicke der Multilayer durch Scratch-Test bestimmt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Abbildung 4. Integration von porösem Titan-Implantaten in vivo in Kaninchen. Haemotoxylin & Eosin Färbung der explantierten Implantat Querschnitte (A) Die porösen Bereiche können vollständig innerhalb eines Zeitraums von 4-6 Wochen in vivo gefüllt werden (B) Das Gewebe innerhalb der Poren ist ein reifes Bindegewebe mit einem guten Maß an Vaskularisierung .
Abbildung 5. Überwachung von Eiweißgehalt von Plasma im Verlauf einer Implantation durch HPLC und anschließende Sequenzierung. Die repräsentativen HPLC Kurven zeigen die Spitzen aus Blutproben von Tieren, die nach 3, 4 und 6 Wochen nach der Implantation bzw. (oben links, oben rechts, unten links erhalten ). Jeder Peak entspricht einem bestimmten Protein. Die Unterschiedein der Spitze entsprechen relative Häufigkeit eines bestimmten Proteins, die durch Sequenzierung (z. B. α-und ß-Ketten ½ Hämoglobin) bestimmt werden kann. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Pore Steigungen sind wichtige Werkzeuge in der Schnittstelle des Tissue Engineering und der hier beschriebene System kann allein oder in Verbindung mit metallischen Implantaten verwendet werden, um Porengradient bilden Zellwanderung studieren. Das System erfordert keine zusätzliche Einstellung oder zusätzliche Ausrüstung mit Ausnahme einer chemischen Abzugshaube gegen organische Lösungsmittel behandeln, so kann es in der Biologie Labors angewendet werden. Ähnliche Polymere wie Poly (Glykolsäure) (PGA), Poly (milch-co-glycol) säure (PLGA) und Poly (caprolacton) (PCL) mit geringen Modifikationen verwendet werden. Andere makroporösen Strukturen, die nicht in organischen Lösungsmitteln auflösen würde können ebenfalls verwendet werden. Zur Erzielung kleiner Porengröße (im Nanometerbereich) auf einer Oberfläche, ist eine zusätzliche dünne Filmschicht nanoporösen Bildung möglich. Dies kann von der ersten Inbetriebnahme einer verdünnten Lösung (1%) des Polymers auf der Oberseite der Struktur in einem leichtflüchtigen Lösungsmittel (z. B. Chloroform) und dann sofort Phasentrennung verursacht wird durch Eintauchen in ap erhalten werdenure Ethanol-Lösung. Dadurch kann eine Co-Kultur-System, das nur einem Material basiert, erhalten werden.
Die Teflon-Form-Design ist entscheidend für die Steuerung der Porengröße als die Bewegung der Extraktionsflüssigkeit durch diese bestimmt wird. Die Bewegung des Extraktionsfluid und des Wechselkurses zwischen dem Extraktionsfluid und das Lösungsmittel beeinflussen die Bildung von Poren. Die Steuerung kann durch Anwendung einer laminaren Strömung der Extraktionsflüssigkeit durch das Implantat verbessert werden. Die Menge Extraktionsflüssigkeit ist ein wichtiger Parameter, und es sollte in Bezug auf die Menge des eingesetzten Polymers sowie in Bezug auf die Größe des Implantats angeordnet ist. Für zylindrische Implantate mit 2mm Dicke und 11 mm Durchmesser von 500 um medizinischem Titan Perlen gebildet eine Extraktion Bad von 200 ml ist erforderlich. Zur Untersuchung der Zellwanderung ist PKH26 eine bessere Option für die langfristige Migration Studien während Calcein-AM bietet eine bessere Beobachtung der Zellmorphologie. Quantification der Zelle Bewegung in z-Richtung ist eine indirekte in vitro Messung der Kontrolle zellulärer Bewegung. Auch dieses System kann mit Endothelzellen für die Quantifizierung der in vitro Vaskularisierung der Implantate verwendet werden, entweder durch direkte Aussaat oder mit Standard-Angiogenese-Assays unter Verwendung von Gel Kapselung 24.
Es gibt mehrere verfügbare Nanofaser Bildung Methoden wie Elektrospinnen oder Phasentrennung, sondern Elektrospinnen von Kollagen wird in der Regel als Kollagenfibrillen denaturieren. Verwendung einer Polyelektrolyt-Struktur stellt die Verhinderung der Denaturierung während die Bereitstellung der erforderlichen Fibrillenstruktur mit hoher Präzision. Auch LbL Methoden sind einfacher für komplexe Implantat Formen anzupassen. Film Schichten auf porösen Strukturen sind einfache Methoden, um Transwell-Assays wie mit mehr Kontrolle über die Wechselwirkungen zwischen den zellulären Komponenten zu entwickeln. Es ist möglich, mit confoca beobachtenl Mikroskopie die obere Schicht auf dem Implantat. Dies kann verwendet werden, um die Wechselwirkung des entsprechenden primären Zellen mit den Multischichten in Kontakt mit dem Implantat, wie Epithelzellen oder Endothelzellen beobachtet werden. Entweder isoliert oder im Handel erhältliche 25 Zellen verwendet werden. Diese Filmschicht eine Oberfläche, wo eine Innenverkleidung für ein rohrförmiges Organ entwickelt werden können. Zum Beispiel kann in diesem speziellen Fall war das Ziel, eine künstliche Membran Luftröhre zu entwickeln und diese Struktur wurde gezeigt, dass für respiratorische Epithel 23.
Die Dicke der Schicht wird auf einem Niveau, wo die Folie dick genug ist, um als Barriere (24 Doppelschichten) zu wirken eingestellt. In beiden nur Titan und Titan / PLLA Implantate aufgrund der Hydrophobie des Substrats eine relativ flache Folienschicht auf den Implantaten, wobei die Poren einen Beitrag zur Stabilität der Grenzfläche zwischen der Struktur und der neu gebildeten Schicht gebildet werden. Unter den verfügbaren Vernetzung michthoden ist genipin Vernetzung am besten geeignet für die Tier-Experimente. Andere Vernetzungsverfahren wie Glutaraldehyd kann EDC / NHS ebenfalls verwendet werden, aber in der Regel in weniger Zellanheftung führen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von photovernetzbaren Kollagen 26.
Protein-Sequenzierung ist eine vielversprechende Methode für die Implantat-Überwachung, da es mehr in ein tiefes Verständnis liefern könnte. Je nach der Art der Proteine erhalten werden, ist es möglich, die systemischen Auswirkungen der Implantation ableiten und auch genau mögliche Infektionen, die besonders wichtig für die Fälle, in denen das Implantat nicht in einem geschlossenen Bereich, wie in dem Fall von trachealen Implantate . Früherkennung von Infektionen können zu Prävention von Infektionen im Zusammenhang mit Komplikationen in einer fristgerechten Weise zu führen. Die HPLC-Profil kann mehr Informationen im Vergleich zu Single Charakterisierung eines bestimmten Proteins, wie CRP oder CGA als mehrere Peaks mit mehreren Proteine von Interesse sein können erhaltened mit dieser Methode. Zum Beispiel haben Alpha-und Beta Hämoglobin ½ Ketten für Kaninchen mit Tracheal Implantate ähnliche Trends mit CRP Lesungen in unserer volle tracheal Ersatz-Modell gezeigt. Solche Vielseitigkeit würde einen Veranstaltungsort für die Bestimmung von Minute systemische Wirkung mit großer Genauigkeit mit der Verbesserung der Techniken beschrieben.
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Disclosures
NE Vrana ist Mitarbeiter von Protip SAS.
Acknowledgments
Autoren danken Herrn Dr. Andre Walder und Nicolas Perrin für die Herstellung von Titan-Implantaten, K. Benmlih für den Aufbau der Teflonformen und Dr. G. Prevost danken für seine Hilfe bei Tierversuchen. Wir erkennen auch die Region Elsass und PMNA (Pole Materiaux et Nanowissenschaften d'Alsace) für eine finanzielle Beteiligung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss | ||
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
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