毛穴グラデーション、高分子電解質とその間接的モニタリングの金属インプラントのマルチスケール変更<em生体内で></em
Summary
このビデオでは、それらの機能を改善し、細胞移動を制御するために多孔性金属インプラントのための改質技術を実証する。技術は、3Dおよび基底膜の製造は2-Dにおける細胞移動を制御する模倣における細胞移動を制御するための細孔勾配の発達が挙げられる。また、血液タンパク質の分析を介して生体内インプラント統合を監視するためのHPLCベースの方法が記載されている。
Abstract
特に、金属インプラント、チタンインプラントは、広く臨床応用に使用されている。組織におけるこれらのインプラントへと統合·成長の組織が成功した臨床転帰のための重要なパラメータである。組織の統合を改善するために、多孔性金属インプラントが開発されてきた。細孔領域は全体構造の機械的特性を損なわずに官能化することができるので、金属発泡体の開気孔率は、非常に有利である。ここでは、チタンのマイクロビーズに基づく多孔質チタンのインプラントを使用して、このような変更を説明します。チタンなどの疎水として固有の物理的性質を用いることにより、基底膜を有するようにマイクロビーズ系金属インプラント内であると同時に疎水性の細孔勾配を得ることができる親水性、天然ポリマーに基づく模倣。 3次元細孔勾配は、例えば、凍結抽出法によるポリ-L-乳酸（PLLA）などの合成ポリマーによって形成されている。 2Dナノファイバーシュール面は天然架橋剤（ゲニピン）との架橋工程に続いて、コラーゲン/アルギン酸塩を用いて形成されている。このナノファイバー膜は2つの反対荷電分子の層（のLbL）蒸着法、コラーゲンとアルギン酸塩によって層によって建てられました。最後に、これは多くの多細胞組織のために必要であるように異なる領域が、異なる細胞型を収容することができるインプラントを得ることができる。により、異なる細胞型によって異なる方向にこのようセルラー移動を制御することができる。このようなシステムは、気管再生の特定の場合について説明するが、他の標的器官のために変更することができる。細胞遊走と異なる孔勾配を作成するための可能な方法の分析が精緻化される。そのようなインプラントの分析における次のステップは、移植後のそれらの特徴付けである。しかし、金属製のインプラントの組織学的分析は、生体内で金属製のインプラントに監視ホスト反応のためにこのように長くて面倒なプロセスですCGAと異なる血液タンパク質監視に基づいてlternative方法も記載されている。これらの方法は、インビトロ 、カスタムメイドの移行およびコロニー形成試験に現像に使用することができ、また、組織学せずインビボで官能化された金属インプラントの分析のために使用される。
Introduction
現在利用可能な金属製のインプラントは、荷重支持用途に適しているが、それらの非分解性はそれらに1を囲む組織との強力な界面を確保するための設計を必要とする。 インビボでのコロニー形成および成長中の細胞促進する構造を設けることにより、金属インプラントの寿命が2延ばすことができる。公然と多孔性金属インプラントは、また、インプラントの良い植民地を確保するための組織界面工学のための材料を約束している。それらが積極的に整形外科用インプラントとして、また、気管3-5インプラントとして使用されている。しかしながら、このような細孔分野における細胞運動を正確に制御するように解決すべき問題が残っています。このプロセスを制御するために、障害が発生しても、他の一端および再狭窄に不完全な植民地化につながる可能性があります。また、これらのインプラントの更なる官能化は、例えば成長因子の送達等の高機能を実現するために必要である、異なる細胞タイプ6-8の指示血管新生と同時移動。血管組織によるインプラントのコロニー形成が望まれるように気管インプラントのために、これは重要である。それはインプラントの開存性を低下させるので、気管内腔への成長の制御不能な組織は望ましくない。
細胞運動を制御するための一つの可能性は、サイズ排除である。標的細胞と指定された合成ポリマーと相互作用する能力の大きさを知ることにより、効果的に細胞運動の深さを決定することができる細孔の勾配を開発することが可能である。例えばこのような外性線維芽細胞などの結合組織細胞の侵入のために十分な大きさですが、管腔内管状インプラントの植民実効支配を彼らの動きを防ぐために（10μm未満）十分に小さい細孔アーキテクチャを作成することによって達成することができる。
このような凍結dryiとして利用ポア作成方法からngの、粒子浸出、9,10発泡ガス、必要な機器の最小限の細孔勾配の迅速形成するための方法を適応するのが最も簡単で凍結抽出11である。この方法では、ポリマー溶液は、有機溶媒と水との二元混合物中で凍結される。その後、溶媒をエタノールなどの混和予め冷却液によって抽出を介して交換される。凍結および抽出条件は、細孔の形状及び大きさを決定し、抽出、抽出液の移動を制御することができる方法で行われている場合、孔サイズおよび形状は一方向に変調することができる。
多細胞組織のための第二のステップは、それらの相互作用を制御するために、異なる細胞タイプ間の多孔障壁の形成である。これはまた、それらの要件12,13に応じて、異なる種類の細胞ごとに異なる微小環境の可用性のために必要である。気管はbronchと喉頭をつなぐ管状の器官である私。それは粘液を作り出す相互分散杯細胞とインナーpseudostratified繊毛上皮の裏地を持っています。気管の3次元構造および安定性がCリング状の軟骨によって維持される。このように、人工的な気管内結合組織と毛様体上皮層の間に定義されて接合があるはずです。 3D構造は結合組織の部分のために必要であるが、上皮細胞の遊走は、創傷の方向の動きとクロージャを達成するために、基底膜のような表面を必要とします。高分子電解質多層膜（PEMは）基底膜の模倣を取得するための一つの可能なオプションです。層毎法（のLbL）は薄く、機能表面コーティングを得るための多用途のプロセスである。それは、その特性がそのような高分子電解質種、pHを単に変える変数によって変化させることができるナノスケールの表面コーティングを得るために順次に2つの反対に荷電した高分子電解質とそのビルドアップ、静電的相互作用に基づいているレイヤ番号、キャッピング層の添加、架橋等のLbL方法の主な利点の1つは、下地基板のトポグラフィに準拠する能力である。このように、制御された条件下でこの方法はまた、多孔質構造の表面被覆率を得るために使用することができる。コラーゲンは、高分子電解質の1つとして使用されている場合には、基底膜の表面を模倣することができるナノファイバーの構造を得ることができる。チタンの疎水性は、14このような構造の開発を可能とfibrillarityは厚いコーティングで保存することができます。この方法は、表面上の細胞の接着と移動も制御することができる。順次抽出し、凍結のLbLフィルムコーティングを用いることにより、細胞運動を長手方向と円周方向に、横方向に制御することができる構造が15を得ることができる。
ここでは、することができ、それらの疎水性の動作を使用することにより、チタンインプラントのための2つの新たな修正方法を説明します疎水性合成ポリマーii）の細胞増殖および高分子電解質多層によるライニングの形成をサポートするインプラント表面上に厚さのポリマーフィルム層の形成とマクロポーラス酸化チタンインプラント内のマイクロポアの勾配のi）の形成：種々の多孔質インプラントの変形例に延長した。これらの方法は、連続的に又は別々に使用することができる。彼らは管理された移行と多細胞組織16,17で異なる種類の細胞の空間的な組織化を確保する構造を提供します。気管の具体的なケースでは、インプラントのための望ましい結果は、再狭窄および高分子電解質多層膜上の繊毛上皮細胞の内側のライニングを形成することなく細孔勾配内線維血管組織による植民地化されるだろう。
インプラントの統合を制御する一つの方法は、in situで 、ホストとの集積化の期間中に小さな外科的介入を行うことである。できるTようにするために介入のタイミングを決定し、O、それはインプラントの全身作用に関する情報を有することが重要である。 C反応性蛋白（CRP）は、感染および臨床の場における炎症反応のモニタリングに使用されている。クロモグラニンAは（CGA）も同様に使用することができ、炎症18のレベルを観察するために、より正確な結果を提供するかもしれない。 インビボでの金属インプラント統合を観察可能な方法として、我々は高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびその後のタンパク質配列決定による動物の血液試料の特性によってインプラント全身作用を連続的に監視手順を示す。この方法の精緻化は、通常、エンドポイント組織学的分析を回避するために使用することができる。金属インプラントの組織切断が長く、面倒で高価なプロセスであり、特定の時点で行うことができる。この理由から、インプラント健康について堅牢な情報を提供する血液検査でしょううまく設計された動物実験に関する最近のEU規則で義務付けられて動物実験を減らすために可能なルートである。
ここに提示方法は官能化を介して、金属インプラントの性能を向上させる、または既存のインプラントを監視する別の方法を有するように使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
細孔勾配は、インタフェース組織工学における重要なツールであり、ここで説明するシステムは、細胞遊走を研究するために細孔勾配を形成するために、単独で、または金属インプラントと組み合わせて使用することができる。システムは、有機溶剤を扱う化学ヒュームフードを除く任意の余分な設定や特別な機器を必要としない、したがって、それは、生物学の研究室に適用すること?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、動物実験で彼の助けのためにビルドアップテフロンモールド博士G.プレボのため製造チタンインプラント博士アンドレワルダーとニコラ·ペラン、K. Benmlihに感謝したいと思います。また、財政的な貢献のために地域アルザスとPMNA（ダルザスポールMateriauxらナノサイエンス）を認める。
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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