تعديل متعدد مقياس من يزرع لامع مع التدرجات مسام، مركبات البولي الكتروليت والمراقبة غير المباشرة<em> في الجسم الحي</em
Summary
في هذا الفيديو، ونحن سوف تظهر تقنيات التغيير لزراعة المعدنية التي يسهل اختراقها لتحسين وظائفها والسيطرة على الهجرة الخلية. وتشمل تقنيات تطوير التدرجات المسام للسيطرة على حركة الخلية في 3D، وإنتاج الغشاء القاعدي يقلد للسيطرة على حركة الخلية في 2-D. أيضا، يتم وصف طريقة تعتمد على HPLC لرصد التكامل زرع في الجسم الحي عن طريق تحليل البروتينات في الدم.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع يزرع لامع، خاصة يزرع التيتانيوم، في التطبيقات السريرية. الأنسجة في النمو والتكامل لهذه الغرسات في الأنسجة هي المعالم الهامة لنتائج سريرية ناجحة. من أجل تحسين التكامل الأنسجة، والتي يجري وضعها يزرع المعدنية التي يسهل اختراقها. فتح المسامية من الرغاوي المعدني هو مفيد جدا، لأن المناطق المسام يمكن functionalized دون المساس الخواص الميكانيكية للهيكل كله. نحن هنا وصف هذه التعديلات باستخدام غرسات التيتانيوم التي يسهل اختراقها على أساس بلي التيتانيوم. باستخدام الخصائص الفيزيائية الكامنة مثل hydrophobicity من التيتانيوم، فمن الممكن الحصول على التدرجات المسام مسعور يزرع داخل microbead معدني مقرها، وفي الوقت نفسه لدينا تقليد الغشاء القاعدي يعتمد على ماء، والبوليمرات الطبيعية. تتشكل التدرجات المسام 3D بواسطة البوليمرات الاصطناعية مثل حمض بولي-L-اللبنيك (PLLA) من خلال طريقة تجميد استخراج. 2D nanofibrillar سورتتشكل الوجوه باستخدام الكولاجين / الجينات تليها خطوة يشابك مع crosslinker الطبيعية (genipin). تم بناء هذا الفيلم nanofibrillar من قبل طبقة بعد طبقة (LBL) طريقة ترسب اثنين من الجزيئات المشحونة معاكس، والكولاجين والجينات. وأخيرا، زرع حيث يمكن استيعاب مناطق مختلفة أنواع مختلفة من الخلايا، وهذا أمر ضروري بالنسبة لكثير من الأنسجة المتعددة الخلايا، يمكن الحصول عليها. من قبل، هذه الحركة الخلوية الطريق في اتجاهات مختلفة حسب أنواع مختلفة من الخلايا يمكن السيطرة عليها. يوصف مثل هذا النظام لحالة معينة من القصبة الهوائية التجديد، ولكن يمكن تعديلها للأجهزة المستهدفة الأخرى. وضعت تحليل للهجرة الخلية والطرق الممكنة لخلق التدرجات المسام مختلفة. الخطوة التالية في تحليل مثل هذه الغرسات هو التوصيف الخاصة بهم بعد الزرع. ومع ذلك، التحليل النسيجي من يزرع المعدني هو عملية طويلة ومرهقة، وبالتالي لرصد رد فعل المضيف ليزرع المعدنية في الجسم الحي على إعطاءكما يتم وصف أسلوب lternative يعتمد على رصد بروتينات الدم CGA ومختلفة. هذه الطرق يمكن استخدامها لتطوير في المختبر الهجرة حسب الطلب والاختبارات الاستعمار ويمكن استخدامها أيضا لتحليل يزرع معدني functionalized في الجسم الحي دون علم الأنسجة.
Introduction
حاليا يزرع المعدنية المتوفرة هي مناسبة للتطبيقات الحاملة، ولكن من غير تحلل يتطلب التصاميم التي تضمن واجهة قوية مع الأنسجة المحيطة بهم 1. من خلال توفير البنى التي تسهل الخلوية في النمو والاستعمار في الجسم الحي، عمر يزرع معدني يمكن رفعه 2. يزرع المعدنية التي يسهل اختراقها بشكل علني والمواد اللازمة لهندسة الأنسجة واجهة واعدة وأيضا لضمان الاستعمار جيدة من يزرع. وقد تم استخدامها بنشاط كما زرع العظام وكذلك زرع القصبة الهوائية 3-5. ومع ذلك، لا تزال هناك مشاكل التي تحتاج إلى حلها مثل دقة السيطرة على حركة الخلية في مناطق المسام. فشل في السيطرة على هذه العملية قد تؤدي إلى استعمار غير مكتملة في نهاية واحدة وعودة التضيق في الآخر. أيضا المزيد من functionalization من هذه الغرسات هو ضروري لتحقيق وظائف أعلى مثل، والتسليم من عوامل النمو،الأوعية الدموية وجهت وحركة في وقت واحد من أنواع مختلفة من الخلايا 6-8. لزراعة القصبة الهوائية، وهذا أمر بالغ الأهمية لأن استعمار زرع من قبل الأنسجة أوعية دموية أمر مرغوب فيه. ومع ذلك، فإن الأنسجة غير المنضبط في نمو إلى تجويف القصبة الهوائية غير مرغوب فيه لأنه يقلل المباح الزرع.
احتمال واحد للسيطرة على حركة الخلية هو حجم الاستبعاد. من خلال معرفة حجم الخلايا المستهدفة وقدرتها على التفاعل مع البوليمر الاصطناعية نظرا لأنها من الممكن تطوير التدرجات من المسامات التي يمكن أن تحدد على نحو فعال عمق حركة الخلية. على سبيل المثال عن طريق إنشاء بنية المسام التي هي كبيرة بما يكفي لدخول خلايا النسيج الضام مثل الخلايا الليفية extraluminally، ولكن صغيرة بما فيه الكفاية (أقل من 10 ميكرون) لمنع حركتهم intraluminally والرقابة الفعالة على الاستعمار من زرع أنبوبي يمكن تحقيقه.
من الأساليب المتاحة خلق المسام مثل تجميد dryiنانوغرام، الرشح الجسيمات والغاز رغوة 9،10، وأسهل طريقة للتكيف لتشكيل سريع من التدرجات المسام مع الحد الأدنى من المعدات اللازمة لتجميد استخراج 11. في هذه الطريقة، يتم تجميد حل البوليمر في خليط ثنائي من مذيب عضوي والمياه. بعد ذلك، يتم تبادل المذيب عن طريق الاستخراج عن طريق السائل قبل المبردة غير قابلة للامتزاج مثل الايثانول. تجميد وشروط استخراج تحديد شكل وحجم المسام وإذا تم استخراج بطريقة حيث يمكن التحكم في حركة الحل استخراج، يمكن أن حجم المسام والشكل يكون التضمين إتجاهي.
الخطوة الثانية لأنسجة متعددة الخلايا هو تشكيل الحواجز التي يسهل اختراقها بين أنواع مختلفة من الخلايا للسيطرة على تفاعلها. وهذا أمر ضروري لمعرفة مدى توافر microenvironments مختلفة لأنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على متطلباتهم 12،13 أيضا. القصبة الهوائية هي جهاز أنبوبي الذي يربط الحنجرة مع الشعبة الهوائيةط. أنه يحتوي على بطانة الداخلية كاذب ظهارة الهدبية مع الخلايا الكأسية interdispersed التي تنتج المخاط. يتم الحفاظ على هيكل 3D والاستقرار من القصبة الهوائية بواسطة غضروف على شكل C-حلقات. وهكذا، في القصبة الهوائية الاصطناعية ينبغي أن يكون هناك تقاطع المعرفة بين النسيج الضام والطبقة الظهارية الهدبية. في حين أن هيكل 3D من الضروري بالنسبة للجزء النسيج الضام، وهجرة الخلايا الظهارية يتطلب غشاء مثل الطابق السفلي سطح لتحقيق حركة الاتجاه وإغلاق الجرح. متضاعف الكتروليتي أفلام متعددة الطبقات (PEMs) هي خيار واحد يمكن الآن الحصول يقلد الغشاء القاعدي. طريقة طبقة تلو طبقة (LBL) هو عملية متعددة الجوانب للحصول على طلاء سطح رقيقة وظيفية. لأنه يقوم على التفاعلات كهرباء من اثنين من مركبات البولي الكتروليت اتهم معاكس وعلى تراكم بطريقة متسلسلة للحصول على طلاء سطح النانو التي يمكن أن تختلف ببساطة عن طريق تغيير المتغيرات مثل الأنواع متضاعف الكتروليتي، ودرجة الحموضة خصائص،عدد طبقة، إضافة طبقة متوجا، الخ يشابك واحدة من المزايا الرئيسية لأسلوب LBL هو قدرته على مطابقة للتضاريس الركيزة الأساسية. وهكذا، تحت ظروف خاضعة للرقابة هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا للحصول على تغطية سطح الهياكل التي يسهل اختراقها. إذا تم استخدام الكولاجين باعتبارها واحدة من مركبات البولي الكتروليت أنه من الممكن الحصول على هياكل nanofibrillar التي يمكن أن تحاكي سطح الغشاء القاعدي. وhydrophobicity من التيتانيوم يمكن تطوير مثل هذه الهياكل وfibrillarity يمكن الحفاظ عليها في طبقات سميكة 14. ويمكن أيضا بهذه الطريقة يمكن التحكم المرفق وحركة الخلية على السطح. باستخدام تجميد استخراج وLBL طلاء الفيلم بالتتابع، هيكل حيث حركة الخلية يمكن التحكم أفقيا، طوليا ومحيطي ويمكن الحصول على 15.
نحن هنا وصف طريقتين تعديل رواية لزراعة التيتانيوم باستخدام سلوكهم مسعور التي يمكن أن تكونمدد لتعديل مختلف يزرع التي يسهل اختراقها: ط) تشكيل التدرجات من micropores داخل يزرع التيتانيوم ماكروبوروس مع مسعور، والبوليمرات الاصطناعية الثاني) تشكيل طبقة فيلم البوليمرية سميكة على سطح الزرع التي تدعم نمو الخلايا وتشكيل بطانة بواسطة متضاعف الكتروليتي متعددة الطبقات. هذه الأساليب يمكن استخدامها بشكل تسلسلي أو بشكل منفصل. أنها توفر الهياكل التي تضمن الهجرة الخاضعة للرقابة والتنظيم المكاني للأنواع مختلفة من الخلايا في الأنسجة المتعددة الخلايا 16،17. لحالة معينة من القصبة الهوائية، فإن النتيجة المرجوة لعملية الزرع تكون الاستعمار من قبل الأنسجة ليفي وعائي داخل التدرجات مسم مكروي دون عودة التضيق وتشكيل البطانة الداخلية للخلايا الظهارية مهدبة على متضاعف الكتروليتي متعددة الطبقات.
طريقة واحدة للسيطرة على التكامل من يزرع هو أن تفعل التدخلات الجراحية الصغيرة خلال الفترة من اندماجهم مع المضيف في الموقع. من أجل أن تكون قادرة رس اتخاذ قرار بشأن توقيت التدخلات، من المهم الحصول على معلومات بشأن الآثار النظامية للزرع. بروتين سي التفاعلي (CRP) قد استخدمت لرصد العدوى والاستجابة الالتهابية في المرافق الصحية. كروموغرانين A (CGA) يمكن أن تستخدم أيضا بطريقة مماثلة، ويمكن أن توفر نتائج أكثر دقة للاطلاع على مستوى من التهاب 18. كوسيلة ممكنة للمراقبة التكامل زرع المعدنية في الجسم الحي، فإننا نقدم إجراء الرصد المستمر لآثار جهازية زرع من قبل توصيف عينات دم الحيوان يعانون من ارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) وتسلسل البروتين اللاحقة. وضع هذه الطريقة يمكن استخدامها للتهرب من التحليل النسيجي نقطة النهاية العادية. القطع النسيجية من يزرع المعدني هو، عملية مرهقة ومكلفة وطويلة لا يمكن إجراؤها إلا في نقطة زمنية محددة. نظرا لهذا السبب، مصممة تصميما جيدا اختبارات الدم توفر معلومات قوية حول صحة زرع سوفتكون الطرق الممكنة لتقليل التجارب على الحيوانات وفقا لما قررته قواعد الاتحاد الأوروبي الأخيرة بشأن التجارب على الحيوانات.
الأساليب المقدمة هنا يمكن استخدامها لتحسين أداء يزرع المعدنية عبر functionalization أو أن يكون وسيلة بديلة للرصد يزرع القائمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التدرجات المسام هي أدوات هامة في هندسة الأنسجة واجهة والنظام الموصوف هنا يمكن استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع يزرع المعدنية لتشكيل التدرج المسام لدراسة الهجرة الخلية. النظام لا يتطلب أي إعداد إضافية أو إضافات إلا غطاء الدخان الكيميائية لمعالجة المذيبات العضوية، و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب أود أن أشكر الدكتور اندريه Walder ونيكولا بيرين لصناعة التيتانيوم يزرع، K. Benmlih لتراكم القوالب تفلون والدكتور G. بريفوست لمساعدته مع التجارب على الحيوانات. ونحن نعترف أيضا منطقة الألزاس وPMNA (القطب MATÉRIAUX آخرون العلوم النانوية D'الألزاس) للمساهمة مالية.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O’Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid – liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization – Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid – liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -. M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
