Gözenek Gradiyentler Polielektrolitler ve Bunların Dolaylı İzleme ile Metalik İmplant Çok Ölçekli Modifikasyon<em> In vivo</em
Summary
Bu videoda, onların işlevselliğini artırmak ve hücre göçü kontrol etmek için gözenekli metalik implantlar için modifikasyon tekniklerini gösterecektir. Teknikleri 3D ve bazal membran üretimi 2-B hücre hareketini kontrol etmek için taklit hücre hareketini kontrol etmek için gözenek geçişlerini geliştirilmesi yer alıyor. Ayrıca, kan proteinlerinin analizi ile in-vivo olarak izlenmesi implant entegrasyonu için bir HPLC-tabanlı bir yöntem tarif edilmektedir.
Abstract
Özellikle metalik implantlar, titanyum implantları, yaygın klinik uygulamalarda kullanılır. Dokularda bu implantlara ve entegrasyon-büyüme Doku başarılı klinik sonuçlar için önemli parametrelerdir. Doku entegrasyonu geliştirmek için, gözenekli metalik implantlar geliştirilmektedir var. Gözenek alanları, bütün yapının mekanik özellikleri tehlikeye atmadan fonksiyonalize edilebilir çünkü metal köpükler açık gözeneklilik çok avantajlıdır. Burada titan, mikro-gözenekli göre titanyum protezler kullanarak bu tür değişiklikleri açıklar. Bu tür titanyum hidrofobik olarak doğal fiziksel özelliklerini kullanarak, bir bazal membran hidrofilik, doğal polimerler esas taklit olması mikroboncuk esaslı metalik implantlar içinde ve aynı zamanda hidrofobik gözenek gradyanları elde etmek mümkündür. 3D gözenek gradyanları gibi dondurarak ekstraksiyon yöntemiyle poli-L-laktik asit (PLLA) gibi sentetik polimerler ile oluşturulmaktadır. 2D nanofibrillar suryüzleri doğal bir çapraz bağlayıcı (genipin) ile bir çapraz bağlama adımı takip kollajen / aljinat kullanılarak oluşturulmaktadır. Bu nanofibrillar film tabakası (LBL) iki zıt yüklü moleküller, kollajen ve aljinat birikimi yöntemi ile tabaka ile inşa edildi. Son olarak, bu pek çok hücreli dokular için gerekli olduğu kadar farklı alanlarda farklı hücre tipleri kalabileceği bir implant, elde edilebilir. Tarafından, farklı hücre tipleri, farklı yönlerde bu şekilde hücresel hareket kontrol edilebilir. Böyle bir sistem, trakea rejenerasyon belirli bir durum için ayrı tarif edilmektedir, fakat diğer hedef organlar için modifiye edilebilir. Hücre göçü ve farklı gözenek gradyanları oluşturmak için olası yöntemleri analizi detaylandırılmıştır. Bu tür implantlar analizinde bir sonraki adım implantasyondan sonra karakterizasyonudur. Ancak metalik implantlar histolojik analiz, in vivo, bir bir metalik implantlar izleme host reaksiyonu için bu nedenle, uzun ve hantal bir süreçtirCGA, farklı kan proteinleri izleme esas lternative yöntem de tarif edilmektedir. Bu yöntemler arasında in vitro ısmarlama göç ve kolonizasyonu testlerinde geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda histolojik olmadan, in vivo olarak işlevselleştirilmiş metalik implantlar analizi için kullanılabilir.
Introduction
Şu anda mevcut metalik implantlar yük taşıyan uygulamalar için uygundur, ancak olmayan nitelik kaybı onları 1 çevreleyen doku ile güçlü bir arayüz sağlamak tasarımları gerektirir. In vivo ve kolonizasyon büyüme hücresel kolaylaştırmak yapılar sağlayarak, metal implantların ömrü 2 uzatılabilir. Açıkça gözenekli metalik implantlar ve aynı zamanda implantların iyi kolonizasyonu sağlamak için doku arayüzü mühendislik malzemeleri umut vericidir. Bunlar aktif ortopedik implantlar gibi ve aynı zamanda trakeal implantlar 3-5 olarak kullanılmıştır. Ancak, gözenek alanlarda hücre hareketi üzerinde kesin kontrol olarak çözülmesi gereken sorunlar hala var. Bu süreci kontrol etmek için başarısızlık bir ucunu ve diğer restenoz içinde eksik kolonizasyon yol açabilir. Ayrıca bu implantlar başka bir işlevselleştirilmesini Bu büyüme faktörlerinin teslim gibi yüksek fonksiyonları gerçekleştirmek için gerekli olan,yönettiği vaskülarizasyon ve farklı hücre tipleri 6-8 aynı anda hareket. Bir damarlı dokusu ile implantın kolonizasyonu arzu edilir olarak trakeal implantlar için, bu çok önemlidir. Bu implant açıklığı azalır Ancak, trakea lümenine-büyüme kontrolsüz doku istenmeyen bir durumdur.
Hücre hareketi kontrol etmek için bir olasılık boyutu dışlanmasıdır. Hedef hücreler ve belirli bir sentetik polimer ile etkileşim yeteneğini büyüklüğü bilerek etkili bir hücre hareketi derinliğini belirlemek gözenek gradyanları geliştirmek mümkündür. Bağ dokusu extraluminally gibi fibroblast gibi hücreler, ancak lümen bir boru implantın kolonizasyonu üzerinde etkili bir kontrol onların hareket etmesini önlemek için (az 10 mikron) kadar küçük girişi için elde edilebilir yeterince büyük bir gözenek mimari oluşturarak örneğin.
Bu donma-dryi olarak mevcuttur gözenek oluşturma yöntemlering, partikül liç, 9,10 köpük gaz, gerekli ekipmanların az miktarda gözenek geçişlerini hızlı oluşumu için yöntem uyum için en kolay dondurma-çıkarma 11'dir. Bu yöntemde, bir polimer çözeltisi bir organik çözücü ve su karışımı içinde bir ikili dondurulur. Daha sonra, çözücü, etanol gibi bir karışabilir önceden soğutulmuş bir sıvı ile ekstraksiyon yoluyla değiştirilir. Dondurma ve ekstraksiyon koşulları gözeneklerin şekil ve boyutunu belirlemek ve ekstraksiyon ekstraksiyon çözeltisi hareketini kontrol edilebilir bir şekilde yapılır, gözenek boyutu ve şekli yönlü olarak modüle edilebilir.
Çok hücreli dokular için ikinci adım, etkileşimi kontrol etmek için farklı hücre tipleri arasında gözenekli engellerin oluşumudur. Bu aynı zamanda onların ihtiyaçlarını 12,13 bağlı olarak farklı hücre tipleri için farklı mikroçevrelerde durumu için gereklidir. Trakea bronş ile gırtlak bağlayan bir boru şeklinde bir organdıri. Bu mukus üretmesine interdispersed goblet hücreleri ile bir iç yalancı siliyer epitel hayır vardır. Trakea 3D yapısı ve istikrar C-halkalar şeklinde kıkırdak tarafından yapılmaktadır. Böylece, bir yapay trakea bağ dokusu ve siliyer epitel tabakası arasında tanımlanan bir birleşme olmalıdır. Bir 3D yapı bağ dokusu parçası için gerekli olsa da, epitel hücrelerin göç bir bazal membran benzeri gerektiren yüzeye, yaranın yönlü hareketi ve kapatma elde etmek. Polielektrolit çok katmanlı filmler (PEMS) bazal membran taklit elde etmek için olası bir seçenek. Katman-by-katman yöntemi (LBL) ince ve işlevsel yüzey kaplamaları elde etmek için çok yönlü bir süreçtir. Bu, özelliklerini bu polielektrolit türü, pH olarak sadece değişen değişkenler tarafından değiştirilebilir nano yüzey kaplama elde etmek için sıralı bir şekilde iki zıt yüklü polielektrolitler ve inşa-up elektrostatik etkileşimleri dayanmaktadırkatman sayısı, bir kapatma tabakasının yanı sıra, LBL yöntemin en önemli avantajlarından çapraz vb Bir temel yüzey topografya uyması için yeteneğidir. Böylece, kontrollü şartlar altında bu yöntem aynı zamanda gözenekli yapıların yüzey kaplaması elde etmek için de kullanılabilir. Kollajen polielektrolitlerin olarak kullanılırsa, bazal membran yüzeyinde taklit edebilir nanofibrillar yapılar elde etmek mümkündür. Titanyum hidrofobik tür yapıların gelişimi sağlar ve fibrillarity kalın kaplama 14 muhafaza edilebilir. Bu şekilde yüzey üzerinde hücre bağlanma hareketi ve aynı zamanda kontrol edilebilir. Ardışık dondurularak ekstraksiyon ve Lbl film kaplama kullanılarak, hücre hareketi ve uzunlamasına çevresel olarak, yanal olarak kontrol edilebilir bir yapı 15 elde edilebilir.
Burada olabilir onların hidrofobik davranış kullanarak titanyum implantlar için iki yeni modifikasyon yöntemleri tarifhidrofobik, sentetik polimerler ii) hücre büyümesi ve polielektrolit çok katmanlı tarafından astar oluşumunu destekler implant yüzeyinde kalın bir polimerik film tabakası oluşumu ile gözenekli titanyum implantlar içinde micropores geçişlerini i) oluşumu: Çeşitli gözenekli implantlar değişiklik uzatıldı. Bu yöntemler, sırayla veya ayrı ayrı kullanılabilir. Bunlar kontrollü göç ve çok hücreli doku 16,17 farklı hücre tiplerinin mekansal organizasyon sağlamak yapıları sağlamak. Trakea özel durum için, implant için istenen sonucu restenoz ve polielektrolit çok katmanlı üzerinde siliyalı epitel hücrelerinin iç astar oluşumu olmadan mikrogözenek geçişlerini içinde fibrovasküler doku ile kolonizasyon olacaktır.
Implantların entegrasyonu kontrol bir yolu yerinde ev sahibi ile entegrasyon döneminde küçük cerrahi müdahaleler yapmaktır. Güçlü t olmak içinmüdahalelerin zamanlaması karar o, bu implant sistemik etkileri hakkında bilgi sahibi olmak önemlidir. C-reaktif protein (CRP) enfeksiyonun izlenmesi ve klinik ortamlarda inflamatuar yanıt için kullanılmıştır. Kromogranin A (CGA) de benzer bir şekilde kullanılabilir ve inflamasyon 18 seviyesini gözlemek için daha kesin sonuçlar sağlayabilir. In vivo metalik implant entegrasyon gözlemleyerek bir şekilde olarak, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC) ve sonraki protein sıralama ile hayvan kan örneklerinin karakterizasyonu ile implant sistemik etkileri sürekli bir izleme prosedürü mevcut. Bu yöntemin hazırlanması normal son nokta histolojik analiz kaçınmak için kullanılabilir. Metalik implantlar histolojik kesme uzun, hantal ve pahalı bir süreçtir ve sadece belirli zaman noktalarında yapılabilir. Bu nedenle, implant sağlığı hakkında sağlam bilgi veren kan testi olacaktır iyi tasarlanmışhayvan deneyleri ile ilgili son AB kuralları tarafından zorunlu olarak hayvan deneyleri azaltmak için olası yolları olabilir.
Burada yer alan yöntem ile fonksiyonlandırma metalik implantlar performansını artırmak için ya da var olan implantlar izlenmesi için alternatif bir yol için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gözenek gradyanları arayüzü doku mühendisliği önemli bir araç olup, burada tarif edilen sistemin, hücre göçü incelemek için gözenek gradyanını meydana getirmek için tek başına ya da metalik implantlar ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Sistem, organik çözücüler işlemek için kimyasal bir davlumbaz dışında herhangi bir ek ayar veya ilave ekipman gerektirir etmez, bu nedenle biyoloji laboratuvarlarında uygulanabilir. Poli (glikolik asit) (PGA), poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) ve po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hayvan deneyleri ile yaptığı yardım için birikmesi teflon kalıp ve Dr G. Prevost için üretim titanyum implantlar Dr Andre Walder ve Nicolas Perrin, K. Benmlih teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca mali katkı için Bölge Alsace ve PMNA (Pole Materiaux et Nanobilimler d'Alsace) kabul.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).
- Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. P. Fabrication methods of porous metals for use in orthopaedic applications. Biomaterials. 27, 2651-2670 (2006).
- Schultz, P., Vautier, D., Charpiot, A., Lavalle, P., Debry, C. Development of tracheal prostheses made of porous titanium: a study on sheep. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 264, 433-438 (2007).
- Janssen, L. M., et al. Laryngotracheal reconstruction with porous titanium in rabbits: are vascular carriers and mucosal grafts really necessary. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 4, 395-403 (2010).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28, 2810-2820 (2007).
- Schultz, P., et al. Polyelectrolyte multilayers functionalized by a synthetic analogue of an anti-inflammatory peptide, alpha-MSH, for coating a tracheal prosthesis. Biomaterials. 26, 2621-2630 (2005).
- Müller, S., et al. VEGF-Functionalized Polyelectrolyte Multilayers as Proangiogenic Prosthetic Coatings. Advanced Functional Materials. 18, 1767-1775 (2008).
- Mills, R. J., Frith, J. E., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J. Effect of Geometric Challenges on Cell Migration. Tissue Engineering Part C-Methods. 17, 999-1010 (2011).
- O’Brien, F. J., Harley, B. A., Yannas, I. V., Gibson, L. J. The effect of pore size on cell adhesion in collagen-GAG scaffolds. Biomaterials. 26, 433-441 (2005).
- Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26, 5474-5491 (2005).
- Budyanto, L., Goh, Y. Q., Ooi, C. P. Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid – liquid phase separation and freeze extraction. J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab Chip. 12, 2165-2174 (2012).
- Huh, D., et al. Reconstituting Organ-Level Lung Functions on a Chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
- Chaubaroux, C., et al. Collagen-Based Fibrillar Multilayer Films Cross-Linked by a Natural Agent. Biomacromolecules. 13, 2128-2135 (2012).
- Huang, Y., Siewe, M., Madihally, S. V. Effect of spatial architecture on cellular colonization. Biotechnology and Bioengineering. 93, 64-75 (2006).
- Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Unger, R. E. Co-culture systems for vascularization – Learning from nature. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, 291-299 (2011).
- Lavalle, P., et al. Dynamic Aspects of Films Prepared by a Sequential Deposition of Species: Perspectives for Smart and Responsive Materials. Advanced Materials. 23, 1191-1221 (2011).
- Zhang, D., et al. Serum concentration of chromogranin A at admission: An early biomarker of severity in critically ill patients. Annals of Medicine. 41, 38-44 (2009).
- Goh, Y., Ooi, C. Fabrication and characterization of porous poly(l -lactide) scaffolds using solid – liquid phase separation. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2445-2452 (2008).
- Vrana, N. E., et al. Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions. Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).
- Dupret-Bories, A., et al. Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep. J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).
- Gasnier, C. Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules. Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).
- Vrana, N. E. Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement. PLoS ONE. 6, e20480 (2011).
- Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).
- Dong, C. -. M., et al. Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen. Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).
