모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em> 생체 내</em
Summary
이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는 모방에서 세포의 움직임을 제어하는 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HPLC 기반 방법이 설명되어 있습니다.
Abstract
특히 금속 임플란트 티타늄 임플란트가 널리 임상 응용에 사용됩니다. 조직에서 이러한 임플란트 및 통합 성장의 조직이 성공적으로 임상 결과에 중요한 매개 변수입니다. 조직 통합을 개선하기 위해, 다공성 금속 임플란트가 개발되고있다. 기공 영역이 전체 구조의 기계적 특성을 손상시키지 않고 기능화 할 수 있기 때문에 금속 폼의 오픈 기공은 매우 유익합니다. 여기에서 우리는 티타늄 마이크로 비드에 따라 다공성 티타늄 임플란트를 사용하여 이러한 수정 사항을 설명합니다. 티타늄의 소수성과 같은 고유의 물리적 속성을 사용하여, 그것은 지하실 멤브레인은 친수성, 천연 고분자를 기반으로 모방하도록 마이크로 비드 기반의 금속 임플란트에서 동시에 소수성 기공 그라디언트를 얻을 수있다. 3D 기공 그라디언트 등의 동결 추출 방법으로 폴리-L-락트산 (PLLA)와 같은 합성 고분자에 의해 형성된다. 2D 나노 섬유 쉬르얼굴은 천연 가교제 (genipin)와 가교 단계에서 다음에 콜라겐 / 알지네이트를 사용하여 형성된다. 이 나노 섬유 필름 층 (LBL) 두 개의 반대로 대전 된 분자 콜라겐과 알긴산의 증착 방법에 의해 계층에 의해 지어졌다. 마지막으로,이 많은 다세포 조직에 필요한대로 다른 지역, 다른 세포 유형을 수용 할 수있는 임플란트를 얻을 수있다. 에 의해 다른 세포 유형에 의해 다른 방향에서이 방법은 세포의 움직임을 제어 할 수 있습니다. 이러한 시스템은 기관 재생의 특정 경우에 대한 설명하지만, 다른 대상 기관에 대해 수정할 수 있습니다. 세포 이동 및 다른 기공 그라디언트를 만들기위한 가능한 방법의 분석은 정교합니다. 이러한 임플란트의 분석의 다음 단계는 이식 후 자신의 특성이다. 그러나 금속 임플란트의 조직 학적 분석은 생체 내에서 금속 임플란트 모니터링 호스트 반응에 따라서 길고 번거로운 과정CGA 및 다른 혈액 단백질을 모니터에 따라 lternative 방법도 설명합니다. 이 방법은 체외 주문품 마이그레이션 및 식민지 테스트에서 개발에 사용될 수 있으며, 조직학없이 생체 기능화 된 금속 임플란트의 분석에 이용된다.
Introduction
현재 금속 임플란트는 하중 어플리케이션에 적합하지만, 자신의 비 분해성 그들에게 1 주변 조직과 함께 강력한 인터페이스를 보장 설계를 필요로한다. 생체과 식민지 성장의 세포 촉진 구조를 제공함으로써, 금속 임플란트의 수명은 2 연장 할 수 있습니다. 공개적으로 다공성 금속 임플란트는 또한 임플란트의 좋은 식민지를 보장하기위한 조직 인터페이스 기술에 대한 자료를 약속합니다. 그들은 적극적으로 정형 외과 임플란트로 또한 기관 이식 3-5 사용되었습니다. 그러나, 기공 분야에서 세포의 움직임을 통해 정확한 컨트롤로 해결해야 할 문제가 여전히있다. 이 프로세스를 제어하지 않으면 한쪽 끝과 다른 쪽 재 협착의 불완전 식민지로 이어질 수 있습니다. 이러한 임플란트의 추가 작용과 같은 성장 인자의 전달과 같은 높은 기능을 달성하기 위해 필요한 것은,감독 혈관 및 다른 세포 유형 6-8의 동시 이동합니다. 혈관 조직에 의한 임플란트의 식민지가 바람직과 기관 이식의 경우, 이것은 매우 중요합니다. 그것은 임플란트 개통을 감소하기 때문에, 기관의 루멘을 성장의 통제 조직은 바람직하지 않다.
세포의 움직임을 제어 할 수있는 하나의 가능성은 크기 배제됩니다. 표적 세포 및 특정 합성 고분자와 상호 작용하는 능력의 크기를 알면 그것은 효과적으로 세포 운동의 깊이를 확인할 수 있습니다 기공 그라디언트를 개발할 수 있습니다. 결합 조직 extraluminally 등의 섬유 아세포와 같은 세포하지만, intraluminally 관 임플란트의 정착에 효과적인 통제를 자신의 움직임을 방지하기 위해 (이하 10 ㎛) 정도로 작은 항목에 대해 수행 할 수있는 충분한 크기의 기공 구조를 만들어 예를 들면 다음과 같습니다.
이러한 동결 dryi으로 사용할 기공 생성 방법에서NG, 입자 침출, 9,10 발포 가스, 필요한 장비의 최소 금액과 기공 그라디언트의 빠른 형성 방법을 적용하는 가장 쉬운 방법은 동결 추출 11이다. 이 방법에서는, 고분자 용액은 유기 용매와 물 바이너리 혼합물에 고정되어 있습니다. 그 후, 용매를 에탄올로 혼합이 미리 냉장 액체에 의해 추출을 통해 교환됩니다. 냉동 및 추출 조건은 모공의 모양과 크기를 확인하고 추출이 추출 용액의 움직임을 제어 할 수있는 방식으로 수행하는 경우, 기공 크기와 모양은 방향성을 변조 할 수 있습니다.
다세포 조직을위한 두 번째 단계는 상호 작용을 제어하는 다른 세포 유형 간의 다공성 장벽의 형성이다. 또한이 요구 사항 12,13에 따라 서로 다른 세포 유형에 대해 서로 다른 미세 환경의 가용성 여부에 대해 필요합니다. 기관은 bronch와 후두를 연결하는 관 기관이다전. 그것은 점액을 생산 interdispersed 받침 달린 컵 셀 내부 pseudostratified 모양체 상피 안감이 있습니다. 기관의 3 차원 구조와 안정성은 C-링 모양의 연골에 의해 유지된다. 따라서, 인공 기관의 결합 조직과 섬모 상피 층 사이에 정의 된 접합이 있어야합니다. 3D 구조는 결합 조직 부분에 필요하지만, 상피 세포의 이동은 기저막을 같이 필요로 표면 상처의 방향 이동 및 마감을 달성 할 수 있습니다. 고분자 전해질 다층 필름 (PEM이) 기저막 모방을 얻을 수있는 하나의 가능한 옵션입니다. 레이어로 레이어 방식 (LBL)는 얇은 기능성 표면 코팅을 얻기 위해 다양한 과정입니다. 그것은 그 같은 속성 고분자 전해질 종, 산도 단순히 변경 변수에 의해 변화 될 수 나노 표면 코팅을 얻기 위해 순차적으로 두 개의 반대로 대전 된 고분자 전해질과 빌드 – 업의 정전기 상호 작용에 근거층 수, 상한 레이어의 추가, LBL 방법의 주요 장점 중 가교 등 하나는 기본 기판의 지형을 준수 할 수있는 기능입니다. 따라서, 통제 된 상황에서이 방법은 또한 다공성 구조의 표면 범위를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 콜라겐은 고분자 전해질의 하나로서 사용되는 경우는 기저막의 표면을 모방 할 수 나노 섬유 구조를 얻을 수있다. 티타늄의 소수성은 구조의 개발을 가능하게하고 fibrillarity 두꺼운 코팅 14에 보존 할 수 있습니다. 이 방법은 표면에 세포 부착 및 이동도 제어 할 수 있습니다. 순차적으로 동결 추출 및 LBL 필름 코팅을 사용하여, 세포의 움직임이 길이 방향과 원주 방향, 횡 방향 제어 할 수있는 구조가 15를 얻을 수 있습니다.
여기에 우리가 할 수있는 자신의 소수성 동작을 사용하여 티타늄 임플란트에 대한 두 개의 새로운 수정 방법을 설명합니다소수성 합성 고분자 II) 세포 성장과 고분자 전해질 다층으로 안감 형성을 지원하는 임플란트 표면에 두꺼운 고분자 필름 층의 형성 거대 티타늄 임플란트에서 미세 기공의 그라디언트 I) 생성 : 다양한 다공성 임플란트의 수정을 연장했다. 이 방법은 순차적으로 또는 개별적으로 사용할 수 있습니다. 그들은 통제 마이그레이션 및 다세포 조직 16,17에있는 다른 세포 유형의 공간적 조직을 위해 구조를 제공합니다. 기관의 특별한 경우를 위해, 임플란트에 대해 원하는 결과는 재 협착 및 고분자 전해질 다층의 섬모 상피 세포의 내부 안감의 형성없이 미세 그라데이션 내에서 섬유 혈관 조직에 의해 식민지화 될 것이다.
임플란트의 통합을 제어하는 방법 중 하나는 현장에서 호스트와의 통합 기간 동안 작은 수술 개입을 할 수 있습니다. 수 t를 위하여개입의 타이밍을 결정 O를, 그것은 임플란트의 전신 효과에 대한 정보를 가지고하는 것이 중요합니다. C-반응성 단백질 (CRP) 감염 감시 및 임상 설정에서 염증 반응에 사용되고 있습니다. Chromogranin은 (CGA)도 비슷한 방식으로 사용할 수 있으며, 염증 18의 수준을 관찰하는 더 정확한 결과를 제공 할 수 있습니다. 생체 내 금속 임플란트의 통합을 관찰 가능한 방법으로, 우리는 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 및 후속 단백질 시퀀싱 동물의 혈액 샘플의 특성에 의해 임플란트 전신 효과의 지속적인 모니터링 절차를 제시한다. 이 방법의 구체화는 정기적으로 엔드 포인트 학적 분석을 회피 할 수 있습니다. 금속 임플란트의 조직 학적 절단 길고 복잡하고 비싼 절차이며 특정 시점에 수행 할 수 있습니다. 이런 이유 때문에, 임플란트 건강에 대해 강력한 정보를 제공하는 혈액 검사를 할 잘 설계동물 실험에 관한 최근의 EU 규정에 의해 위임으로 동물 실험을 줄일 수 라우트합니다.
여기에 제시된 방법은 기능화를 통한 금속성 임플란트의 성능을 향상시키기 위해 또는 기존의 임플란트를 모니터링하는 다른 방법을 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기공 그라디언트 인터페이스 조직 공학에 중요한 도구이며, 여기에 설명 된 시스템은 세포 이동을 연구하기 위해 기공 그라데이션을 형성 혼자 또는 금속 임플란트와 함께 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 유기 용매를 처리하는 화학 물질 흄 후드를 제외한 모든 추가 설정 또는 추가 장비를 필요로하지 않습니다, 따라서 그것은 생물학 실험실에서 적용 할 수 있습니다. 같은 폴리 (글리콜 산) (PGA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 동물 실험에 그의 도움을 축적 테프론 금형 및 박사 G. Prevost에서의 위해 제조 티타늄 임플란트 박사 앙드레 왈더와 니콜라스 페린, K. Benmlih에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 재정적 기여 지역 알자스와 PMNA (폴 MATERIAUX 등 Nanosciences 달자)을 인정합니다.
Materials
| Reagent | |||
| Dioxane | Sigma-Aldrich | 360481 | Toxic material, Strictly under chemical hood |
| PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g |
Sigma-Aldrich | 94829, 81273 | The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent. |
| PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate) | Novamatrix | 4200006 | Low viscosity(20-200 mPa.s) |
| Collagen type I (Bovine) | Symatese | CBPE2US100 | |
| Pen/Strep, Fungizone | Promocell | C42020 | |
| Genipin | Wako | 0703021 | |
| Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. | Bruker | MSCT | |
| Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0% | Sigma-Aldrich | 302031 | Hazardous Material, Please follow MSDS carefully |
| Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9% | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | C3100MP | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL | |
| Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit | Genway Bio | GWB-9BF960 | |
| DMSO, Bioreagent, ≥99.7% | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Equipment | |||
| Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope | Bruker | ||
| Procise microsequencer | Applied Biosystems | ||
| Ultima 3000 HPLC system | Dionex | ||
| Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100 | Hitachi | ||
| Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 | Zeiss |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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