Multi-Scale Modifikasjon av Metallic implantater med Pore overgangar, polyelectrolytes og deres Indirekte Monitoring<em> In vivo</em

Summary

I denne videoen vil vi demonstrere modifisering teknikker for porøse metalliske implantater for å forbedre funksjonaliteten og for å kontrollere celle migrasjon. Teknikker inkluderer utvikling av pore gradienter for å kontrollere celle bevegelse i 3D og produksjon av basalmembran etterligner å kontrollere celle bevegelse i 2-D. Dessuten er en HPLC-basert fremgangsmåte for å monitorere implantat integrering in vivo via analyse av blod-proteiner beskrevet.

Abstract

Metalliske implantater, spesielt titan implantater, er mye brukt i kliniske applikasjoner. Vev-vekst og integrasjon til disse implantatene i vev er viktige parametere for vellykkede kliniske resultater. For å forbedre vev integrasjon, har porøse metalliske implantater under utvikling. Åpen porøsitet av metallisk skum er meget fordelaktig, siden pore områdene kan bli funksjonalisert uten å svekke de mekaniske egenskapene til hele strukturen. Her beskriver vi slike endringer ved hjelp av porøse titanimplantater basert på titan microbeads. Ved hjelp av iboende fysikalske egenskaper slik som hydrofobisitet av titan, er det mulig å få hydrofobe pore gradienter innenfor microbead baserte metalliske implantater og på samme tid å ha en basalmembran etterligner basert på hydrofile, naturlige polymerer. 3D pore gradienter er dannet av syntetiske polymerer slik som poly-L-melkesyre (PLLA) med fryse-ekstraksjonsmetoden. 2D nanofibrillar suroverflater er dannet ved hjelp av kollagen / alginat etterfulgt av en fornetning trinn med en naturlig tverrbinder (genipin). Dette nanofibrillar filmen ble bygget opp av lag på lag (LBL) deponering metode av de to motsatt ladede molekyler, kollagen og alginat. Til slutt, et implantat hvor ulike områder kan imøtekomme ulike celletyper, da dette er nødvendig for mange flercellede vev, kan fås. Av, denne måte cellulær bevegelse i forskjellige retninger ved forskjellige celletyper bli kontrollert. Et slikt system er beskrevet for det spesielle tilfellet at luftrøret regenerering, men den kan modifiseres for andre målorganer. Analyse av celle migrasjon og mulige metoder for å skape ulike pore gradienter utdypes. Det neste trinnet i analysen av slike implantater er deres karakterisering etter implantasjon. Imidlertid er histologisk analyse av metalliske implantater en lang og besværlig prosess, og dermed for overvåking vert reaksjon på metalliske implantater in vivo en enlternative metode basert på overvåking CGA og forskjellige blodproteiner er også beskrevet. Disse metodene kan brukes for å utvikle in vitro skreddersydde migrering og kolonisering tester og også benyttes for analyse av funksjonaliserte metalliske implantater in vivo uten histologi.

Introduction

For tiden tilgjengelige metalliske implantater er egnet for belastninger, men deres ikke-nedbrytbarhet nødvendiggjør design som sikrer et sterkt grensesnitt med vevet som omgir dem ^en. Ved å gi strukturer som letter cellulær-innvekst og kolonisering in vivo, kan levetiden av metalliske implantater bli forlenget ^2. Åpenlyst porøse metalliske implantater er lovende materialer for vev-grensesnitt engineering og også for å sikre god kolonisering av implantater. De har vært aktivt brukt som ortopediske implantater og også som luftrør implantater ^3-5. Det er imidlertid fremdeles problemer som må løses for eksempel nøyaktig kontroll over cellebevegelse i pore områder. Unnlatelse av å styre denne prosess kan føre til ufullstendig kolonisering i en ende og restenose i den andre. Også videre funksjonalisering av disse implantatene er nødvendig for å oppnå høyere funksjoner som for eksempel, levering av vekstfaktorer,rettet vascularization og samtidig bevegelse av ulike celletyper ^6-8. For tracheal implantater, er dette særlig viktig ettersom kolonisering av implantatet med en vaskularisert vev er ønskelig. Imidlertid er ukontrollert vev-innvekst til lumen av luftrøret uønsket fordi den reduserer implantatet åpenhet.

En mulighet til å kontrollere celle bevegelse er størrelsen eksklusjon. Ved å kjenne størrelsen av målcellene og deres evne til å interagere med en gitt syntetisk polymer er det mulig å utvikle gradienter av porer som effektivt kan bestemme dybden av cellebevegelse. For eksempel ved å lage en pore arkitektur som er stort nok for oppføringen av bindevev-celler slik som fibroblaster extraluminally, men tilstrekkelig små (mindre enn 10 mikrometer) for å hindre deres bevegelse intraluminally en effektiv kontroll over kolonisering av en rørformet implantat kan oppnås.

Fra tilgjengelige pore opprettelse metoder som fryse-tørking ong, partikkel utvasking, gass skummende ^9,10; lettest å tilpasse metoden for rask dannelse av pore gradienter med minimal mengde av nødvendig utstyr er fryse-ekstraksjon ^11. I denne metoden blir en polymerløsning frosset i en binær blanding av et organisk løsningsmiddel og vann. Deretter blir oppløsningsmidlet utveksles via ekstraksjon av en blandbar pre-kjølt væske så som etanol. Frysing og ekstraksjonsbetingelsene bestemmer formen og størrelsen av porene, og hvis uttak er gjort på en måte hvor bevegelsen av ekstraheringsoppløsning som kan kontrolleres, kan pore-størrelse og form være retningsborede modulert.

Andre trinn for flercellede vev er dannelsen av porøse barrierer mellom ulike celletyper å kontrollere deres interaksjon. Dette er også nødvendig for tilgjengeligheten av ulike microenvironments for ulike celletyper avhengig av deres behov ^12,13. Luftrøret er et rørformet organ som forbinder strupehodet med bronchjeg. Den har en indre pseudostratified ciliarepitelet fôr med interdispersed beger celler som produserer slim. 3D-strukturen og stabiliteten av trachea blir vedlikeholdt av brusk i form av C-ringer. Således, i en kunstig luftrøret bør det være en definert overgang mellom bindevev og Ciliary epitellaget. Mens en 3D-struktur er nødvendig for bindevev del, krever migrering av epitelceller en basalmembran-lignende overflate for å oppnå retningsbestemt bevegelse og lukking av såret. Polyelektrolytt flerlags filmer (PEM) er en mulig alternativ for å skaffe basalmembran etterligner. Lag-for-lag-metoden (LBL) er en allsidig fremgangsmåte for oppnåelse av tynne og funksjonelt overflatebelegg. Den er basert på elektrostatiske interaksjoner av to motsatt ladde polyelektrolytter, og deres varmeutvikling i en sekvensiell måte for å oppnå nanoskala overflatebelegg hvis egenskaper kan varieres ved ganske enkelt å endre variabler som polyelektrolytt arter, pH,lag nummer, tillegg av en tildekking lag, tverrbindende etc. En av de viktigste fordelene med LbL metoden er dens evne til å samsvare med topografien i underliggende substrat. Således, under kontrollerte betingelser av denne metoden kan også benyttes for å fremskaffe overflatedekning av porøse strukturer. Hvis kollagen blir brukt som en av de polyelektrolytter er det mulig å oppnå nanofibrillar strukturer som kan etterligne overflaten av basalmembran. Hydrofobisiteten av titan muliggjør utvikling av slike strukturer og fibrillarity kan bli bevart i tykke lag ^14. På denne måten feste og bevegelse av celle på overflaten kan også bli kontrollert. Ved å benytte fryse-ekstraksjon og LbL filmbelegg sekvensielt, kan en struktur hvor celle bevegelse kan styres sideveis i lengderetningen og omkretsretningen fås ^15.

Her beskriver vi to nye modifikasjon metoder for titan implantater ved å bruke deres hydrofobe atferd som kan væreutvidet til modifisering av forskjellige porøse implantater: i) dannelse av gradienter av mikroporer i de makroporøse titanimplantater med hydrofobe, syntetiske polymerer ii) dannelse av et tykt polymerisk film-sjikt på overflaten på implantatet som støtter cellevekst og foring dannelse av polyelektrolytt multilayers. Disse metoder kan benyttes sekvensielt eller separat. De gir strukturer som sikrer kontrollert migrasjon og romlig organisering av ulike celletyper i flercellede vev ^16,17. For det konkrete tilfellet av luftrøret, ville det ønskede resultatet for implantatet være kolonisering av fibrovascular vev i Micropore gradienter uten restenose og dannelsen av den indre foring av ciliated epitelceller på polyelektrolytt multilayers.

En måte å kontrollere integrering av implantater er å gjøre små kirurgiske inngrep i ​​løpet av deres integrering med verten in situ. For å være i stand to bestemme timing av tiltakene, er det viktig å ha informasjon om de systemiske effekter av implantatet. C-reaktivt protein (CRP) er blitt brukt til overvåkning av infeksjon og inflammatoriske respons i kliniske omgivelser. Kromogranin A (CGA) kan også benyttes på en lignende måte, og kan gi mer nøyaktige resultater for å observere graden av betennelse ^18.. Som en mulig måte å observere metallisk implantat integrering in vivo, presenteres en fremgangsmåte for kontinuerlig overvåkning implantat systemiske virkninger etter karakterisering av dyreblod prøver med høytrykks-væskekromatografi (HPLC) og påfølgende protein-sekvensering. Nærmere beskrivelse av denne metode kan benyttes til å unngå vanlig ende-punkt histologisk analyse. Histologisk skjæring av metalliske implantater er en lang, tungvint og kostbar prosess og kan bare foretas på bestemte tidspunkter. På grunn av denne grunn, godt utformet blodprøver gi robuste informasjon om helse implantatet villevære mulige ruter for å redusere dyreforsøk som mandat av de siste EU-regler om dyreforsøk.

Metodene som presenteres her, kan brukes for å forbedre ytelsen til metalliske implantater via funksjonalisering, eller å ha en alternativ måte å overvåke de eksisterende implantater.

Protocol

En. Utarbeidelse av Micropore overgangar i macroporous Metallic implantater Rens implantater (slik som implantater laget av medisinsk kvalitet titan-perler med en størrelse i området 400-500 um, Neyco SAS, Frankrike) med etanol og deretter sonicate i aceton i 15 min. Utvikling og produksjon Teflon støpeformer i henhold til implantatet størrelse og form (For standard forsøk, er sylindriske støpeformer av 1,5 cm diameter med en høyde på 2 cm brukes). Stanseverktøy bør være modulær, slik at…

Representative Results

Dannelse av pore gradienter Ved å forandre konsentrasjonen av PLLA-løsning, er det mulig å kontrollere størrelsen av porene på extraluminal side av implantater. Porestørrelse og formen ble signifikant påvirket av tilstedeværelsen av titanimplantater (figurene 1a og 1b). Porestørrelser varierte 40-100 mikrometer og utnyttelse av lavere konsentrasjoner resulterte i mindre porer. Mens, i den intraluminale side porestørrelse ble styrt av den begrensede ek…

Discussion

Pore ​​gradienter er viktige verktøy i grensesnittet tissue engineering og systemet som beskrives her kan brukes alene eller sammen med metalliske implantater for å danne pore gradient å studere celle migrasjon. Systemet ikke nødvendiggjøre noen ekstra innstilling eller ekstra utstyr bortsett fra et avtrekksskap å håndtere organiske løsemidler, slik at det kan brukes i biologi laboratorier. Lignende polymerer slik som poly (glykolsyre) (PGA), poly (melkesyre-ko-glykol) syre (PLGA) og poly (kaprolakton) (PCL)…

Materials

			Reagent
Dioxane	Sigma-Aldrich	360481	Toxic material, Strictly under chemical hood
PLLA i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g	Sigma-Aldrich	94829, 81273	The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.
PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)	Novamatrix	4200006	Low viscosity(20-200 mPa.s)
Collagen type I (Bovine)	Symatese	CBPE2US100
Pen/Strep, Fungizone	Promocell	C42020
Genipin	Wako	0703021
Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1.	Bruker	MSCT
Trifluoroacetic acid for HPLC ,≥99.0%	Sigma-Aldrich	302031	Hazardous Material, Please follow MSDS carefully
Acetonitrile, for HPLC ,≥99.9%	Sigma-Aldrich	34998
Calcein-AM	Invitrogen	C3100MP
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	PKH26GL
Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit	Genway Bio	GWB-9BF960
DMSO, Bioreagent, ≥99.7%	Sigma-Aldrich	D2650
			Equipment
Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope	Bruker
Procise microsequencer	Applied Biosystems
Ultima 3000 HPLC system	Dionex
Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100	Hitachi
Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510	Zeiss

Table 1. List of Materials and Reagents.