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Bioengineering

Desorption electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जैविक ऊतकों की इमेजिंग

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorption electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री (देसी-एमएस) जैविक ऊतकों सहित नमूने,, कम से कम नमूना तैयार करने के साथ imaged किया जा सकता है जिसके द्वारा एक परिवेश विधि है. आयनीकरण जांच नीचे नमूना rastering रूप से, यह स्प्रे तकनीक आधारित ऊतक वर्गों के भीतर ब्याज की आणविक सुविधाओं विचार करने के लिए पर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान करता है.

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) माइक्रोन पैमाने के दसियों के लिए सैकड़ों की संख्या में जैविक ऊतकों की जांच के लिए सर्वोच्च विशिष्टता और स्थानिक संकल्प के साथ अलक्षित आणविक जानकारी प्रदान करता है. परिवेशी परिस्थितियों में प्रदर्शन किया, नमूना पूर्व उपचार प्राप्त जानकारी की उच्च गुणवत्ता को बनाए रखते हुए इस प्रकार प्रोटोकॉल को सरल बनाने, अनावश्यक हो जाता है. Desorption electrospray ionization (देसी) भी vivo में खुली हवा में सतहों के प्रत्यक्ष नमूना लेने के लिए अनुमति देता है कि एक स्प्रे आधारित परिवेश एमएसआई तकनीक है. एक सॉफ्टवेयर नियंत्रित नमूना मंच के साथ इस्तेमाल किया, नमूना देसी आयनीकरण जांच नीचे rastered है, और समय डोमेन के माध्यम से, मी / z जानकारी रासायनिक प्रजाति 'स्थानिक वितरण के साथ जोड़ा जाता है. देसी-एमएसआई उत्पादन की निष्ठा नमूना सतह और मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रवेश के संबंध में स्रोत अभिविन्यास और स्थिति पर निर्भर करता है. इस के साथ साथ, हम मैं देसी के लिए ऊतक वर्गों तैयार करने के लिए कैसे की समीक्षाmaging और सीधे छवि गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले अतिरिक्त प्रयोगात्मक शर्तों. विशेष रूप से, हम देसी-एमएसआई ने चूहे के मस्तिष्क ऊतक वर्गों की इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है.

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अलक्षित इमेजिंग खोज और परिकल्पना पैदा अनुप्रयोगों के लिए रासायनिक जानकारी के अधिग्रहण की सुविधा. दूसरी ओर ब्याज की एक ज्ञात रासायनिक का लक्षित इमेजिंग,, विशिष्ट पद्धति के विकास के माध्यम से वृद्धि की संवेदनशीलता और चयनात्मकता सुविधा कर सकते हैं. मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) सबसे अधिक MALDI, 1 माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एस), 2 और desorption electrospray ionization (देसी), 3 लेजर पृथक-electrospray ionization (LAESI), 4 सहित परिवेश आयनीकरण तकनीक का प्रयोग करके ऊतकों पर किया जाता है 5 और MALDI और एस में तरल सूक्ष्म जंक्शन सतह के नमूने जांच (LMJ-एसएसपी). 6, नमूने शारीरिक नमूना से हटाया जाना है, और वे उच्च वैक्यूम के तहत विश्लेषण कर रहे हैं के रूप में, फ्लैट और पतली होना है. MALDI नमूना तैयार करने के लिए एक अतिरिक्त और बोझिल कदम जोड़ने, एक विकिरण को अवशोषित मैट्रिक्स के साथ नमूने की कोटिंग की आवश्यकता है. एसउच्चतम पार्श्व संकल्प किया है, लेकिन अत्यधिक ऊर्जावान कणों के साथ बमबारी व्यापक आणविक विखंडन का कारण बनता है. न्यूनतम नमूना तैयार करने के साथ नरम विश्लेषण वांछनीय है जहां इसलिए, परिवेश तरीकों से एमएसआई एक जगह को भरने. लेकिन, आज तक, सभी तरीकों अभी भी फ्लैट नमूना सतहों की आवश्यकता द्वारा सीमित हैं.

देसी analytes desorb और योण बनाना नमूना सतह के निर्देश पर एक pneumatically की मदद का आरोप लगाया विलायक स्प्रे का उपयोग करता है. 7 देसी द्वारा desorption और बाद में आयनीकरण के लिए काम कर मॉडल "पिकअप मॉडल छोटी बूंद 'के रूप में जाना जाता है. 8-10 आरोप लगाया प्राथमिक बूंदों देसी जांच द्वारा निर्मित यह गीला और विश्लेष्य एक ठोस तरल microextraction तंत्र द्वारा सतह से निकाले सामग्री युक्त माध्यमिक बूंदों की गति हस्तांतरण और टेकऑफ़ में 8 बाद छोटी बूंद टकराव का परिणाम भंग कर रहा है जिसमें एक पतली फिल्म बनाने की, सतह से टकराने . 9,10 अंततः, गैसचरण आयनों लेकिन देसी में सटीक आयन गठन की प्रक्रिया प्रयोगात्मक साबित होना अभी बाकी है आयन वाष्पीकरण, प्रभारी अवशेषों मॉडल या अन्य मॉडलों, 11 के बाद ईएसआई जैसी प्रक्रियाओं के माध्यम से उत्पादन किया जा करने के लिए माना जाता है. 12 देसी संवेदनशीलता की घुलनशीलता पर दृढ़ता से निर्भर है स्प्रे विलायक में विश्लेष्य, desorption के रूप में स्थानीय microextraction पर निर्भर करता है. 13

एक सॉफ्टवेयर नियंत्रित नमूना मंच के साथ इस्तेमाल किया, नमूना लेन देसी आयनीकरण जांच के नीचे घुसने साथ unidirectionally जांच होती है, और समय डोमेन के माध्यम से, मी / z जानकारी रासायनिक प्रजाति 'स्थानिक वितरण (चित्रा 1) के साथ जोड़ा जाता है. 2006 में वैन Berkel और Kertesz द्वारा रिपोर्ट सिद्धांत देसी-एमएसआई प्रयोग का पहला सबूत के बाद से, 14 तकनीक लिपिड का विश्लेषण, 3,16 दवा मेटाबोलाइट्स, 17,18 disea रिपोर्ट में अनुप्रयोगों के साथ, काफी 15 परिपक्व हो गया हैसे बायोमार्कर, 19 मस्तिष्क के ऊतकों, 3,18,20 फेफड़े के ऊतकों, 18 गुर्दे ऊतक, 18 वृषण ऊतक, 18 अधिवृक्क ग्रंथियों, 17 पतली परत क्रोमैटोग्राफी प्लेटों, 21 और शैवाल सतहों. देसी-एमएसआई द्वारा प्राप्त चित्र के 22 दिनचर्या संकल्प है अंततः स्प्रे से निकाले प्रभावी सतह क्षेत्र द्वारा निर्धारित किया जाता है, लेकिन 40 माइक्रोन के रूप में कम के रूप में संकल्प सूचित किया गया है, जो 100-200 माइक्रोन,. 23-25 ​​तरह के संकल्प और विश्लेषण की आसानी तेजी से और सरल विश्लेषण के लिए उपयुक्त देसी-एमएसआई बनाता है मूल्यवान स्थानिक जानकारी के अधिग्रहण के लिए बेहतर जैविक प्रक्रियाओं 26 को समझने के लिए सक्रिय करने के 0.5-5 सेमी 2 रेंज में सतह क्षेत्रों के साथ जैविक ऊतकों के नमूनों की. इधर, एक ठेठ देसी-एमएसआई आवेदन का एक उदाहरण के रूप में, हम चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में लिपिड शामिल इमेजिंग एक सफल प्रयोग के संचालन की प्रक्रिया संबंधी विवरण की समीक्षा करें. प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंनीचे वर्णित के रूप में ऊतक तैयारी 27 और देसी आयन स्रोत अनुकूलन,.

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Protocol

1. ऊतक

  1. स्टोर सेक्शनिंग के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में फ्लैश जमी, पूरे ऊतक.
  2. ऊतक नमूना (30 मिनट) सेक्शनिंग से पहले cryomicrotome में तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं. -30 डिग्री सेल्सियस तक ब्लेड और नमूना तापमान सेट
  3. एक बार ऊतक, चिमटी के साथ नमूना हैंडलिंग, तापमान पर पहुँच क्या मस्तिष्क के हिस्से (यानी मस्तिष्क के सामने प्राथमिक महत्व का है, अगर मस्तिष्क के पीछे माउंट पर्याप्त बढ़ते सतह के लिए ब्याज की है पर निर्भर करता है कि मस्तिष्क के सामने या पीठ में कटौती की है चक पर).
    1. यह solidifies जब तक केंद्र में चक को ~ 0.5 मिलीलीटर इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर, ऊतक टेक, सकुरा) लागू करें और, चिमटी का उपयोग कर, अक्टूबर में जगह में नमूना पकड़. एक बार अक्टूबर पूरी तरह से नमूना धारक में माउंट चक, जमे हुए है.
    2. नमूना माउंट किया अक्टूबर के एक न्यूनतम राशि (अक्टूबर के एक ब्लॉक में नमूना बढ़ते के विपरीत रूप में आमतौर पर अन्य histo में किया जाता है पसंद हैनमूना के प्रदूषण को कम करने के लिए तार्किक प्रक्रियाओं). अक्टूबर से नमूना के प्रदूषण देसी और आयन दमन के कारण इमेजिंग प्रक्रिया के लिए हानिकारक है.
  4. मोटाई में 12-18 माइक्रोन से एमएस इमेजिंग श्रेणी के लिए आवश्यक विशिष्ट ऊतक वर्गों. की सिफारिश की सीमा के भीतर वांछित मोटाई पर धारा ऊतकों. हल्के खंड पर एक कमरे के तापमान खुर्दबीन गिलास स्लाइड छूकर प्रत्येक sectioned ऊतक पिघलना माउंट. एक नमूना मुहिम शुरू की है एक बार जब यह रासायनिक वितरण और रचनाओं बदल जाएगा के रूप में, ऊतक अनुभाग को छूने के लिए नहीं सावधानी बरतें.

नोट: हम एक अनुकूलन के लिए खंड, और इमेजिंग के लिए अन्य का उपयोग करते हुए, स्लाइड प्रति दो वर्गों बढ़ते सलाह देते हैं. वर्गों एक स्लाइड बॉक्स में डिग्री सेल्सियस फ्रीजर तक -80 में तत्काल इमेजिंग, दुकान स्लाइड्स के लिए विश्लेषण के लिए तैयार नहीं हैं. हैं

  1. संग्रहीत वर्गों का विश्लेषण करते हैं, फ्रीजर से स्लाइड को हटा दें, तुरंत निर्वात desiccator के लिए स्थानांतरण, और अनुमति ~ 15-20गल मि. अब desiccator में नमूना छोड़कर नमूना सूखी और देसी क्षमता कम हो जाएगा. यह समय के हित में है, तथापि, thawed है एक बार देसी आयन स्रोत का अनुकूलन ऊतक के नमूने के साथ किया जाएगा, नमूना विगलन है अवधि के दौरान जो उपकरण का प्रारंभ करने के लिए एक आदर्श समय के रूप में कार्य करता है.
    1. विलायक देसी रूप में 1% एसिटिक एसिड के साथ acetonitrile का प्रयोग, 5 μl / मिनट की एक प्रवाह दर के साथ सिरिंज पंप पर बारी. एक कम प्रवाह दर देसी स्प्रे और प्रभावी पिक्सेल आकार के प्रभाव को मौके की ओर कम हो जाएगा, लेकिन एक उच्च प्रवाह की दर पर्याप्त संवेदनशीलता के लिए आवश्यक हो सकता है. इसलिए प्रवाह दर (आमतौर पर 1-5 μl / मिनट) हर आवेदन और वांछित संवेदनशीलता और संकल्प के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. सिरिंज दी प्रवाह दर पर पूर्ण अनुकूलन और इमेजिंग के लिए पर्याप्त विलायक होता है कि सुनिश्चित करें.
    2. विलायक स्रोत टिप के बाहर टपकता प्रकट होने के बाद, एक pressur साथ नाइट्रोजन nebulizing गैस पर बारी160 साई के ए.
    3. 3,600 आवेदन करने आयन स्रोत से जुड़े उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति चालू करें वी.
  2. गति मंच पर स्लाइड माउंट और आयन स्रोत और एमएस अनुकूलन शुरू

2. देसी अनुकूलन

  1. देसी प्रणाली एक स्रोत जांच (चित्र 2 देखें), एक सिरिंज और पंप या वैकल्पिक विलायक वितरण प्रणाली, संकुचित नाइट्रोजन, अनुवाद नमूना मंच और माउंट के होते हैं. मास स्पेक्ट्रोमीटर उपयुक्त जन सीमा और ब्याज की analytes के लिए देखते होते ही देसी स्रोत अनुकूलन के साथ आगे बढ़ें.
    1. स्रोत घटकों पर अभी तक चालू नहीं किया गया है, दिशाओं के लिए वर्गों 1.5.1-3 को देखें.
    2. इन वर्गों में चर्चा चर जैविक ऊतकों की इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं. हालांकि इन चर ऊतक या नमूना के विभिन्न प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. वैकल्पिक सॉल्वेंट, प्रवाह दर, nebulizing गैस के दबाव और voltages imagi के लिए सूचित किया गया हैजैविक ऊतकों की एनजी. 16-18
  2. शुरू में देसी स्रोत गिलास स्लाइड छू नहीं, और ऊतक खंड के किसी भी हिस्से में निर्देशित नहीं है कि सुनिश्चित करें. यह जांच प्रारंभिक अनुकूलन प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त नहीं है और ऊतक के नमूने के साथ संपर्क में आने से सेट के किसी भी भाग को दूषित नहीं होगा कि यह सुनिश्चित करेंगे.
    1. एक अच्छा शुरू करने की स्थिति 55 के कोण पर जांच के साथ टिप नमूना सतह से 3 मिमी और एमएस केशिका इनलेट से 5 मिमी, डिग्री नमूना सतह के लिए सम्मान के साथ साथ है. देसी जांच के भीतरी केशिका बाहरी केशिका परे ~ 1 मिमी का विस्तार करना चाहिए. इन मानकों के सभी अनुकूलित किया जाएगा.
  3. केशिका एमएस इंटरफ़ेस आयनों का इष्टतम हस्तांतरण के लिए नमूना की सतह के लिए सम्मान के साथ ~ 15 ° का एक संग्रह कोण होना चाहिए. केशिका रूप में बंद के रूप में संभव है, सतह से <1 मिमी होना चाहिए; नमूना सतह पर एमएस केशिका घूमता है तो उस अवस्था ऊंचाई समायोजित करेंबिना छुए.
  4. वे सीधे लाइन में हैं कि इतने एमएस केशिका प्रवेश के संबंध में एक्स आयाम में देसी जांच संरेखित करें.
  5. अतिरिक्त ऊतक अनुभाग का उपयोग कर इष्टतम संवेदनशीलता के लिए देसी स्रोत के वाई और जेड के पदों पर समायोजित करें. देसी जांच एक नमूना क्षेत्र में निर्देशित है के रूप में, यह अंततः desorb और इस रूप में होता है कि क्षेत्र और संकेत में analytes की सब धीरे - धीरे कम हो जाएगा योण बनाना होगा कि ध्यान दें. इस कदम के रूप में जल्दी संभव प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है.
    1. इसलिए, अनुकूलन प्रक्रिया के दौरान, नमूना ताजा नमूना संकेत में किसी भी बदलाव के स्रोत अनुकूलन, नहीं नमूना कमी की वजह से कर रहे हैं और विश्लेषण किया जा रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए स्प्रे सिर के नीचे ले जाया जाना चाहिए. हालांकि, ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों की विभिन्न रासायनिक संरचना, पूरे ऊतक अनुभाग भर आयन तीव्रता का एक प्रत्यक्ष तुलना पूरी तरह सही नहीं है कि विचार. मस्तिष्क के चेतक के साथ एक हद तक बड़े आकार के क्षेत्र प्रदान करता हैअधिक सुसंगत रासायनिक संरचना, लेकिन अभी भी पूरी तरह से वर्दी नहीं. वैकल्पिक रूप से, एक डाई rhodamine होता है जो लाल Sharpie, का अंकन 6G ([एम] + मीटर z / 443), दूर नमूना से गिलास स्लाइड पर देसी द्वारा एक मजबूत एमएस प्रतिक्रिया प्रदान करता है और भी अनुकूलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन अलग नमूना प्रपत्र और विश्लेष्य दिया, इन शर्तों अभी भी जैविक ऊतकों के लिए सेट अप एक आदर्श के लिए सहसंबंधी नहीं हो सकता है.
    2. स्रोत टिप और केशिका इनलेट के बीच की सिफारिश वाई जुदाई: ~ 4 मिमी, टिप और नमूना की सतह के बीच की सिफारिश की जेड जुदाई: ~ 1.5 मिमी. इन मापदंडों प्रत्येक प्रयोगात्मक सेट अप के लिए थोड़ा अलग होगा हालांकि.
    3. जांच की ज्यामिति और कोण को ध्यान में रखते, वाई और जेड आयाम पदों विलायक और विश्लेष्य युक्त बूंदों के प्रभावी संचरण के संबंध में अंतर से संबंधित है कि खाते में ले. एक चर में एक परिवर्तन एक ही स्प्रे प्रभाव की स्थिति बनाए रखने के लिए और अन्य में एक बाद में संशोधन की आवश्यकता होगीइसके प्रसारण कोण.
  6. दूरी अधिकतम संवेदनशीलता, और कम प्रभाव के स्थान आकार के लिए स्रोत के बाहरी केशिका से भीतरी केशिका extrudes समायोजित करें. सावधानी: इस समायोजन कर रही है जबकि उच्च वोल्टेज बंद है सुनिश्चित करें.
  7. अधिकतम संकेत मनाया जाता है जब स्रोत ज्यामिति इष्टतम विचार किया जाएगा.
    1. वर्गों 2.5-2.6 में अनुकूलित चर परस्पर संबंधित हैं, इसलिए एक के समायोजन स्वाभाविक दूसरे का फिर से समायोजन खंड में चर्चा आवश्यक स्रोत नमूना इनलेट ज्यामिति, या शर्तों का समायोजन 1.5.1-बनाए रखने के लिए की आवश्यकता होगी 3.
  8. इसके अतिरिक्त, मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए केशिका स्थानांतरण आसपास के एक हीटिंग तत्व आयनीकरण प्रक्रिया के दौरान उत्पादन का आरोप लगाया विश्लेष्य बूंदों की desolvation सुविधा से संवेदनशीलता में सुधार हो सकता है. यहाँ हम एक रस्सी हीटर का उपयोग हस्तांतरण आसपास coiled 100 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट केशिका

3. Tissuई इमेजिंग

  1. इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, नमूना मंच केशिका देसी जांच और एमएस प्रवेश के नीचे नमूना चलता रहता है और सभी अन्य घटकों स्थिर बने हुए हैं. मंच की गति मापदंडों देसी प्रभाव पंख आकार और इष्टतम संवेदनशीलता के आधार पर चुना जाना चाहिए.
    1. एक बड़ा प्रभाव पंख तथापि इमेजिंग के लिए, यह भी एक बड़ा पिक्सेल आकार और इस तरह खराब छवि संकल्प का परिणाम देगा, अधिक नमूना desorbed किया जा रहा है यह देखते हुए कि एक उच्च आयन तीव्रता, में परिणाम होगा.
  2. इस प्रयोग में इस्तेमाल किया अनुवाद चरण है घर का निर्माण किया है और दिए गए आयामों की एक छवि के लिए गति और पंक्ति रिक्ति rastering के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है कि एक Labview के कार्यक्रम के द्वारा नियंत्रित किया. इस प्रयोग में इस्तेमाल चरण गति नियंत्रण छठी omnispect.bme.gatech.edu पर उपलब्ध है. वैकल्पिक रूप से, एक वाणिज्यिक उपलब्ध देसी स्रोत और मंच ऐसे Prosolia इंक से 2 डी स्वचालित ओमनी स्प्रे स्रोत (इंडियानापोलिस, संयुक्त राज्य अमेरिका में) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एकविशिष्ट छवि का आकार 10 x 15 मिमी, और इस्तेमाल चरण प्रस्ताव मापदंडों दिया है, छवि लगभग 3 घंटे का समय लगेगा.
      1. कार्यक्रम Labview के छठे या वांछित इमेजिंग स्थितियों के लिए बराबर नियंत्रण सॉफ्टवेयर, एक मंच स्कैन 80 माइक्रोन की गति / सेक, और 200 मीटर की पंक्तियों के बीच पंक्ति रिक्ति का उपयोग कर. ओमनी स्प्रे स्रोत का उपयोग करते समय, गति मापदंडों 100-200 माइक्रोन / सेकंड की एक स्कैन गति और 200 माइक्रोन की एक पंक्ति रिक्ति के लिए सेट किया जाना चाहिए. इन गति मापदंडों के प्रत्येक आयाम और आवश्यक संवेदनशीलता में वांछित पिक्सेल की संख्या के आधार पर बदला जा सकता है कि ध्यान दें.
        1. एक छोटे पंक्ति रिक्ति स्कैन गति एक प्रभाव के कम होने के साथ, छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए दिखाया गया है. 25 बहरहाल, यह, यह जरूरी नहीं संकेत मिलता है और बेहतर छवि संकल्प नहीं है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि के रूप में प्रभाव मौके पर ही निर्भर है आकार. एक धीमी स्कैन गति और छोटे पंक्ति रिक्ति काफी विश्लेषण के समय में वृद्धि होगी और इसलिए optimi होना चाहिएऊतक या नमूना के प्रत्येक प्रकार के लिए जेड.
      2. पंक्ति रिक्ति वाई आयाम में पिक्सेल आकार निर्धारित करता है जबकि एमएस वर्णक्रमीय अधिग्रहण 1 पर सेट के साथ स्कैन / सेक, और 1 पिक्सेल / स्कैन के रूप में बनाया छवि, मंच गति, एक्स आयाम में पिक्सेल आकार को परिभाषित करता है. छवि का सच पिक्सेल आकार प्रसार स्प्रे करने के लिए इस वजह से भी बड़ा है, धीमी गति desorption और का पता लगाने के लिए और अधिक समय की अनुमति देता है.
    2. निर्देशिका पथ और Labview के छठे भीतर छवियों के दौरान दर्ज होने की स्थिति और समय फ़ाइलों के लिए फ़ाइल नाम दें.
  3. जन वर्णक्रमीय डाटा अधिग्रहण के लिए तैयार करने में, इमेजिंग के लिए आवश्यक कुल समय की गणना. हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल Labview कार्यक्रम स्वचालित रूप से इस मूल्य प्रदान करता है, लेकिन वैकल्पिक मंच नियंत्रण प्रयोग किया जाता है, इस गणना एमएस डाटा अधिग्रहण सेटिंग्स के लिए आवश्यक है.
    1. एक ओमनी स्प्रे स्वचालित स्रोत और मंच का उपयोग कर, छवि की प्रत्येक पंक्ति में के रूप में प्राप्त कर लिया हैजुदा चलाता है. समय प्रति लाइन और दिया इमेजिंग आयामों के लिए आवश्यक लाइनों की संख्या मास स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर में निवेश करने ओमनी स्प्रे नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं.
  4. मास स्पेक्ट्रोमीटर स्कैन गति 1 स्पेक्ट्रम / सेक है कि यह सुनिश्चित करें, और गणना की कुल समय से मिलान करने के साधन के अधिग्रहण के समय निर्धारित किया है.
    1. वर्णक्रमीय स्कैन गति 1 स्पेक्ट्रम / सेकंड पर सेट करें.
    2. शख्सियत मोड में डेटा मोल और मी / z रेंज ब्याज की प्रजातियों के लिए उपयुक्त है कि यह सुनिश्चित करें. कि देसी भी ईएसआई के रूप में, गुणा आरोप लगाया analytes का उत्पादन करता है याद रखें.
    3. Labview के द्वारा दिए गए कुल छवि समय से मिलान करने के अधिग्रहण के समय निर्धारित करें.
  5. Imaged किया जा क्षेत्र के शीर्ष बाएँ में स्प्रे के प्रभाव हाजिर स्थिति.
  6. एक साथ एमएस डेटा और मंच प्रस्ताव का अधिग्रहण शुरू करो.
  7. डाटा अधिग्रहण के समापन पर, स्टैंडबाय मोड के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर वापसी.
  8. देसी स्रोत के उच्च वोल्टेज बंद करें.
  9. ओ बारीएफएफ नाइट्रोजन गैस.
  10. सिरिंज पंप बंद करें.

4. इमेज प्रोसेसिंग

  1. मास वर्णक्रमीय डेटा, चरण समय और Labview के माध्यम से पाठ फ़ाइलों के रूप में सहेजे स्थिति डेटा के साथ संयोजन में इसी स्पेक्ट्रा के साथ पिक्सल के निर्देशांक correlating एक 2 डी छवि में "मुड़ा" किया जाना चाहिए. omnispect.bme.gatech.edu: यहां प्रस्तुत छवियों पर आसानी से उपलब्ध है कि Matlab आधारित सॉफ्टवेयर का उपयोग संसाधित किया गया. डेटा ओमनी स्प्रे स्रोत का उपयोग कर हासिल कर रहे हैं, जुगनू डेटा रूपांतरण सॉफ्टवेयर BioMAP (www.maldi-msi.org) में छवि दृश्य के लिए डेटा क्यूब बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. Jeol AccuTOF मास स्पेक्ट्रोमीटर पर अधिग्रहीत डेटा के लिए, दर्ज वर्णलेख आगे के विश्लेषण के लिए. Cdf प्रारूप में निर्यात किया जाना चाहिए.
    1. MassCenter भीतर DataManager का प्रयोग, पहली centroided डेटा (उपकरण → Centroid को acquistion डाटा कन्वर्ट) के लिए अधिग्रहीत डेटा परिवर्तित. तब कुंजीपटल संयोजन Ctrl + Shift + ई fol के उपयोग करके. Cdf प्रारूप में डेटा निर्यातउपकरण → निर्यात से इजाजत दे दी.
  3. OmniSpect वेबसाइट के लिए कच्चे. Cdf जन वर्णक्रमीय डेटा और दो पाठ फ़ाइलें, स्थान और समय, अपलोड करें. जुगनू संसाधित इमेजिंग डेटा BioMAP में देखे जा सकते हैं.
    1. गैर नकारात्मक मैट्रिक्स Factorization द्वारा सांख्यिकीय विश्लेषण सहित या ब्याज की एक एकल आयन की साजिश रचने डेटा की आगे की प्रक्रिया वेबसाइट पर सीधे किया जा सकता है.
    2. वैकल्पिक रूप से, कच्चे डेटा घन Matlab में विश्लेषण के लिए निर्यात किया जा सकता है.

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Representative Results

चित्रा 3 एक अनुपचारित चूहे के मस्तिष्क अनुभाग से प्राप्त एक प्रतिनिधि स्पेक्ट्रम को दर्शाता है. सकारात्मक मोड में, जन स्पेक्ट्रम उनकी उच्च आयनीकरण क्षमता (सकारात्मक आरोप लगाया चतुर्धातुक अमोनियम समूह को जिम्मेदार ठहराया) के कारण phosphatidylcholines का बोलबाला है. ऊतक अनुभाग की कुल आयन छवि भी पूरे मस्तिष्क अनुभाग भर में प्रचुर मात्रा में संकेत दिखा रहा है, 3 चित्र में दिखाया गया है. पता चला कुंजी लिपिड साहित्य तुलना के माध्यम तालिका 1 में पहचाने जाते हैं.

उदाहरण लिपिड के स्थानिक वितरण (चित्रा 4) विभिन्न phosphatidylcholine प्रजातियों के रिश्तेदार बहुतायत ग्रे और मस्तिष्क की सफेद पदार्थ के बीच होती है कि कैसे दिखा. [पीसी 36:1 कश्मीर +] + मी / z 826.5558, वृद्धि की तीव्रता में पता चलता है, जबकि उदाहरण के लिए, [पीसी 34:1 कश्मीर +] + मी / z 798.5364, अनुमस्तिष्क प्रांतस्था (ग्रे बात) में वृद्धि की तीव्रता से पता चलता है अनुमस्तिष्क डंठल (whi हैते बात नहीं). दो आयनों (चित्रा 4C) के लिए प्राप्त समग्र छवि ऊतक अनुभाग भर में लिपिड वितरण में विपरीत प्रकाश डाला गया. मस्तिष्क में अन्य प्रमुख लिपिड के स्थानिक वितरण भी 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं. इन वितरण पिछले अध्ययनों से सहमत हूँ. 28-30

चित्रा 1
चित्रा 1. देसी-एमएसआई इमेजिंग प्रक्रिया. देसी (एक) के योजनाबद्ध ऊतकों की सतह के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, और नमूना (ख) स्रोत नीचे एक नियंत्रित गति में rastered है, जब बड़े पैमाने पर वर्णक्रमीय डेटा, तीव्रता बनाम मी / z (ग है ), समय के एक समारोह के रूप में (घ) का अधिग्रहण किया है. इस डाटा तो एक रासायनिक छवि बनाने के लिए प्रस्ताव मानकों के साथ समय डोमेन के माध्यम से जोड़ा जाता है(ई). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. देसी स्रोत के योजनाबद्ध.

चित्रा 3
चित्रा 3. अधिक प्रचुर मी / z मूल्यों के साथ औसत पूरे ऊतक स्पेक्ट्रम लेबल (एक) और कुल आयन छवि (ख) सकारात्मक आयन मोड में देसी-एमएसआई ने अधिग्रहण कर लिया.

चित्रा 4 4 चित्रा. सकारात्मक आयन मोड में देसी-एमएसआई द्वारा अधिग्रहीत चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में महत्वपूर्ण phosphocholines के आयन छवियों का चयन किया, (एक) [पीसी 34:1 कश्मीर +] + मी / z 798.5364, (ख) [पीसी 36:1 कश्मीर +] + , मी / z 826.5558; मीटर z / 798, नीले, और 826, लाल (ग) समग्र छवि.

जाति मी / z स्थानीयकरण (बात)
[पीसी 32:0 + ना] + 756.5335 ग्रे
[पीसी 32:0 कश्मीर +] + 772.5165 ग्रे
[पीसी 36:4 + एच] + 782.5477 सफ़ेद
[पीसी 34:1 कश्मीर +] + 798.5364 ग्रे
[पीसी 38:4 + एच] + सफ़ेद
[पीसी 36:1 कश्मीर +] + 826.5558 सफ़ेद

तालिका 1. मस्तिष्क अनुभाग के भीतर प्रमुख लिपिड पहचान और स्थानीयकरण.

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Discussion

देसी स्रोत ज्यामिति के अनुकूलन सफल एमएसआई प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. प्रणाली के संरेखण के लिए योगदान एकाधिक चर सीधे संवेदनशीलता और छवि संकल्प प्रभावित करते हैं. अनुकूलन के दौरान, प्रयोगकर्ता संकेत प्राप्त कठिनाइयों है, तो हम एक बेंचमार्क के रूप में स्लाइड पर तैयार की लाल Sharpie के स्थान का उपयोग करने की सलाह देते हैं, डाई, rhodamine 6G, मी / z 443, सकारात्मक आयन मोड में एक मजबूत संकेत पैदा करता है और के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रारंभिक अनुकूलन. विश्लेष्य पारेषण और आयनीकरण का गठन पतली फिल्म में सतह से analyte की निकासी पर निर्भर करता है के रूप में इसके अतिरिक्त, देसी लिए विलायक चयन, संवेदनशीलता के लिए महत्वपूर्ण है. 13 कई electrospray आयनीकरण संगत विलायकों और मिश्रण desolvation में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और आयनीकरण प्रक्रिया के विश्लेषण के दौरान ब्याज की चक्रवृद्धि की श्रेणी पर निर्भर करता है.

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, देसी-एमएस छवि depe का संकल्पमुख्य रूप से स्रोत पर रेखागणित एनडीएस. इस लेजर आधारित और / या ~ 10-150 माइक्रोन से. 5,31 संकल्प के रूप में उच्च 40 माइक्रोन लेकर कर सकते हैं जो vacuo इमेजिंग तरीकों की तुलना में अधिक है हालांकि 200 माइक्रोन के आदेश पर छवि संकल्प नियमित रूप से, देसी-एमएसआई द्वारा प्राप्त की है देसी, 24 तथापि, दिनचर्या इमेजिंग के लिए 200 माइक्रोन बड़े जैविक ऊतक वर्गों के विश्लेषण के लिए पर्याप्त है का उपयोग कर सूचना दी गई है. देसी स्रोत के केशिका भीतरी जुड़े सिलिका की गुणवत्ता भी छवि गुणवत्ता और संकल्प को प्रभावित करेगा. बड़े आईडी केशिकाओं बड़ा स्प्रे और बड़ी छवि संकल्प उत्पादन के रूप में केशिका की सिफारिश की भीतरी व्यास 50 माइक्रोन है. इस केश का उचित रूप से नहीं काट रहा है या टूट जाता है तो 25, स्प्रे अनियमित आकार असर हाजिर में जिसके परिणामस्वरूप शंक्वाकार हो, गरीब नहीं होगा गुणवत्ता और irreproducible छवियों.

इतना ही नहीं स्रोत ज्यामिति देसी-एमएसआई के संकल्प को प्रभावित करता है, यह भी संवेदनशीलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता हैविधि की. इसलिए ज्यामिति अनुकूलित और प्रक्रिया के दौरान स्थिर रखा जाना चाहिए. नमूना तलीय नहीं है, या क्षैतिज पूरी तरह से जोड़ा नहीं है, तो स्रोत ज्यामिति इस प्रकार की प्रतिक्रिया बदल रहा है और छवि के भीतर एक विरूपण साक्ष्य बनाने, बदल जाएगा. 23 देसी-एमएसआई तलीय नमूने लिए सीमित है, हालांकि, जैविक ऊतकों की 3 डी इमेजिंग किया जाता है फिर एक तीन आयामी छवि में खड़ी दिखती हैं जो धारावाहिक ऊतक वर्गों के 2 डी इमेजिंग के माध्यम से संभव है. 32 यह दृष्टिकोण भी एस, MALDI, LAESI, आदि 33 तीन आयामी मास स्पेक्ट्रोमेट्री छवियों को भी हो सकता है सहित अन्य एमएसआई विधियों, के लिए नियोजित किया जा सकता है क्रमिक उदाहरण के लिए लेजर दालों द्वारा सामग्री की परतों को हटाने, और reimaging के द्वारा बनाई गई. 34

चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों के सकारात्मक मोड विश्लेषण phosphatidylcholines और कुछ दवाओं और मेटाबोलाइट्स की सफल इमेजिंग की सुविधा. 18 इस विश्लेषण के पूरक हैं, negativ में इमेजिंगई मोड लिपिड, 28,35 की कक्षाओं का एक बड़ा विविधता के साथ एक स्पेक्ट्रम का उत्पादन और ऊतक वर्गों के लिए एक व्यापक विश्लेषण प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक से अधिक लिपिड प्रजातियों एक विशेष मी / z मूल्य के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है जहां मामलों में, अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री भी लिपिड पहचान की पुष्टि के लिए एक अतिरिक्त विधि के रूप में कार्य करता है. 35

देसी द्वारा परिवेश मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों में लिपिड प्रजातियों की इमेजिंग में प्रभावी होना दिखाया गया है. एमएसआई प्रयोगों के माध्यम से प्राप्त सूचना अन्य लोगों के अलावा सिंड्रोम, और मधुमेह के नीचे इस तरह के अल्जाइमर रोग के रूप में phospholipids की बदल स्तर, के साथ जुड़े रोगों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. 36-38 लिपिड और जैविक प्रक्रियाओं में उनकी भूमिकाओं के उच्च बहुतायत को देखते हुए कई जैविक प्रणाली मौजूद उस मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त जानकारी से लाभ होगा. कई संभावित तरीकों के साथविशेष रूप से मास स्पेक्ट्रोमेट्री, परिवेश आयनीकरण तरीकों, देसी उपयोग कर छवि जैविक नमूने लिए, कम नमूना तैयार करने के साथ ऐसा करने के लिए एक साधन उपलब्ध कराने और विश्लेषण में आसानी वृद्धि हुई.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम ARRA के NSF के एमआरआई साधन विकास अनुदान # 0923179 निश्चित करने के द्वारा समर्थित है. हम ऊतक सेक्शनिंग के साथ सहायता के लिए एक्वा Asberry, बायोइन्जिनियरिंग के लिए पार्कर एच. पेटिट संस्थान और बायोसाइंसेज प्रोटोकॉल कोर के लिए लैब समन्वयक, धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 77 आण्विक जीवविज्ञान बायोमेडिकल इंजीनियरिंग रसायन विज्ञान जैव रसायन बायोफिज़िक्स भौतिक विज्ञान सेलुलर जीवविज्ञान आण्विक इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री एमएस एमएसआई Desorption electrospray आयनीकरण देसी परिवेश मास स्पेक्ट्रोमेट्री ऊतक सेक्शनिंग बायोमार्कर इमेजिंग

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

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Rachel V. Bennet

Desorption electrospray ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जैविक ऊतकों की इमेजिंग
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Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

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