بروتوكول لالتعريفي الجيني والتخيل من أورام حميدة والغازية في رأسي مجامع<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em
Summary
التعاون بين الجين الورمي تفعيلها مثل RAS V12 والطفرات في جينات الخلية القطبية مثل خربش، يؤدي إلى نمو الأورام في ذبابة الفاكهة حيث عرض الخلايا السرطانية أيضا السلوكيات الغازية. هنا يتم تقديم بروتوكول بسيط للتحريض والمراقبة من الأورام الحميدة والغازية.
Abstract
وقد مضيئة ذبابة الفاكهة فهمنا للأساس الجيني للتطور الطبيعي والمرض على مدى العقود القليلة الماضية، واليوم لا تزال تساهم بشكل كبير في فهمنا للأمراض المعقدة 1-7. تطور أورام حميدة من إلى حالة النقيلي هو حدث معقد 8 و تم غرار ذبابة الفاكهة في لتساعدنا على فهم أفضل الأسس الجينية لهذا المرض 9. أنا هنا تقديم بروتوكول بسيط للحث وراثيا، ومراقبة وتحليل ثم تطور الأورام في يرقات ذبابة الفاكهة. ويستند أسلوب الحث الورم على النظام MARCM 10 ويستغل التعاون بين الجين الورمي تفعيلها، رأس V12 وفقدان الجينات قطبية الخلية (خربش، وأقراص كبيرة وقاتلة اليرقات العملاقة) لتوليد الأورام الغازية 9. أنا شرح كيفية يمكن تصور هذه الأورام في يرقات سليمة وثم كيف يمكن تشريح هذه خارج لمزيد من التحليل. بروتوكول مبسطة المقدمة هنا ينبغي أن تجعل من الممكن لهذه التقنية لاستخدامها من قبل المحققين المهتمين في فهم دور الجينات في غزو الورم.
Introduction
تطور أورام حميدة من إلى حالة النقيلي هو عملية خطوة حكيمة التي تتميز التهرب من آليات الحماية الموجودة في الجسم 8. على سبيل المثال الخلايا السرطانية في الجسم يجب أن تكون قادرة على التهرب من موت الخلايا المبرمج وجهاز المناعة، واختراق المصفوفة خارج الخلية المتخصصة (ECM) يسمى الغشاء القاعدي، والتغلب على أي الضوابط الاجتماعية التي تفرضها الخلايا المحيطة 8. فمن خلال التقدم خطوة حكيمة أن الخلايا السرطانية اكتساب القدرة على ترحيل مواقع بعيدة في عملية تسمى الانبثاث واستعمار. فهمنا لكيفية يتغلب على الخلايا السرطانية الحواجز المفروضة من قبل الهيئة لا تزال في مهدها، ومع ذلك، فإن الصورة الناشئة من الأبحاث التي أجريت حتى الآن نقطة إلى الاستخدام المتكرر للعمليات التنموية العادية ومسارات الإشارات من الخلايا السرطانية 11-13.
ذبابة الفاكهة قد ساهم الى حد كبير في ذبابة الفاكهة السوداء البطن اوند لديناerstanding من التطور الطبيعي والمرض من خلال استخدام تقنيات وراثية متطورة وضعت على مدى العقود العديدة الماضية 14-17. باستخدام الطفرات وأدوات من overexpression اننا وصلنا الى فهم أفضل لمختلف الجينات المسرطنة والجينات الكابتة ورم 18-22. ومع ذلك، الورم ورم خبيث هو نتيجة للتعاون بين العديد من الآفات الجينية التي تمت دراستها في المقام الأول في نماذج الثقافة الخلية 23،24 فضلا عن مختلف نماذج طعم أجنبي 25-27. على الرغم من هذه النماذج قوية لديها قيود لأنها لا تحاكي تماما الظروف الموجودة في الكائن الحي. وعلاوة على ذلك، والنماذج المعدلة وراثيا المتوفرة في الفئران هي مرهقة ولا يفضي إلى التحليل الجيني للسلوك الغازية 28،29. وقد حاولت العديد من الدراسات لفهم غزو الخلايا السرطانية في ذبابة الفاكهة 30،31. هذه التقنيات تستخدم في المقام الأول زرع الأورام الأولية إلى المضيفين ومن ثم الاعتماد على تتبع هيئة تنظيم الاتصالاتnsplanted أورام لغزو الأنسجة المجاورة 32،33. تم تكييفها وهناك تقنية قوية تسمى MARCM 10 بواسطة Pagliarini وشو لنموذج غزو الورم في ذبابة الفاكهة 9. هذه النمذجة الوراثية أنيقة من غزو الورم استغلت التعاون بين الجين الورمي تنشيط وفقدان قطبية الخلية. قوة هذه النمذجة يكمن في حقيقة أن الأورام الغازية تم إنشاؤها في كائن حي سليمة وبالتالي الالتفاف على الحاجة لزرع الأنسجة. لتحقيق التعاون أنكجنيك، يتم التعبير عن الجين الورمي تفعيلها مثل رأس V12 في استنساخ الخلايا في العين antennal القرص اليرقات. نتيجة لهذه التقنية MARCM وتتميز هذه الحيوانات المستنسخة أيضا مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لسهولة التصور ومصنوعة متماثلة اللواقح بالنسبة المسوخ قطبية الخلية مثل يرقات القاتلة العملاقة، خربش، والأقراص الكبيرة. والنتيجة هي GFP الموسومة الأورام الغازية في مجمع رأسي. في هذا التقرير الأولشرح كيفية حمل، ووضع تصور لهذه الأورام الغازية سواء في سياق يرقات سليمة وتشريح خارج مجمع رأسي. تحريض الورم المقدمة هنا تستخدم الكواشف على كروموسوم الثاني من ذبابة الفاكهة. في الجدول 2، وتقديم قائمة من الأسهم على X و 3 الثالثة الكروموسومات التي يمكن استخدامها لنفس الغرض. وأعتقد أن هذا البروتوكول المبسط سوف تجعل هذه التقنية في متناول الجميع للباحثين المهتمين في فهم الأساس الجزيئي لتطور الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
السرطان هو مرض معقد مع فهم أفضل بكثير اليوم مما كانت عليه في الماضي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه يحتاج وأوضح من قبل لدينا صورة كاملة عن الآليات الكامنة. بروتوكول المعروضة هنا بسيطة يجعل من الممكن للحث على راثيا الأورام الحميدة والغازية في الحي كله ومن…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم البحوث في مختبري قبل وزارة WKU الأموال بدء التشغيل الأحياء، بحوث WKU مؤسسة RCAP-I منح # 11-8032 وبمنحة KBRIN-AREA تمويلها من خلال منحة الوالد من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية الصحة تحت رقم الجائزة 5P20GM103436-13. وأود أيضا أن أنوه الدكتور تيان شو في التي تعرفت على هذه التقنية، والدكتور ريموند Pagliarini الذين أنشئت لأول مرة هذه التقنية في المختبر شو المختبر.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
Referências
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genética. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genética. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genética. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
