Un protocolo para la inducción genética y visualización de tumores benignos y invasoras en cefálica Complejos de<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Cooperación entre un oncogén activado como RAS V12 y las mutaciones en los genes de polaridad celular como garabateado, resultar en el crecimiento tumoral en Drosophila donde las células tumorales también muestran comportamientos invasivos. Aquí se presenta un protocolo sencillo para la inducción y la observación de los tumores benignos y invasivos.
Abstract
Drosophila ha iluminado nuestra comprensión de las bases genéticas del desarrollo normal y la enfermedad de las últimas décadas y hoy en día sigue contribuyendo en gran medida a nuestra comprensión de las enfermedades complejas 1-7. La progresión de los tumores de comportamiento benigno a un estado metastásico es un evento complejo 8 y ha sido el modelo en Drosophila para ayudarnos a entender mejor la base genética de esta enfermedad 9. Aquí presento un protocolo sencillo para inducir genéticamente, observar y luego analizar la progresión de los tumores en las larvas de Drosophila. La técnica de inducción del tumor se basa en el sistema de MARCM 10 y explota la cooperación entre un oncogén activado, Ras V12 y la pérdida de genes de polaridad celular (íntima, discos grande y letal larvas gigante) para generar tumores invasivos 9. Demuestro cómo estos tumores pueden ser visualizados en las larvas intactas yentonces, ¿cómo estos pueden ser disecados para su posterior análisis. El protocolo simplificado presentado aquí debería hacer posible que esta técnica para ser utilizada por los investigadores interesados en la comprensión de la función de un gen en la invasión tumoral.
Introduction
La progresión de los tumores de un benigna a un estado metastásico es un proceso sabia paso que se caracteriza por la evasión de los mecanismos protectores presentes en el cuerpo 8. Por ejemplo células tumorales en el cuerpo ha de ser capaz de evadir la apoptosis y el sistema inmune, avance la matriz extracelular especializada (ECM) denominada membrana basal, y superar los controles sociales impuestas por las células circundantes 8. Es a través de un paso de progresión prudente que las células cancerosas adquieren la capacidad de migrar y colonizar sitios distantes en un proceso denominado metástasis. Nuestra comprensión de cómo la célula tumoral supera las barreras impuestas por el cuerpo está todavía en su infancia, sin embargo, el cuadro que surge de las investigaciones realizadas hasta el momento los puntos a un uso repetido de los procesos normales de desarrollo y vías de señalización de las células de cáncer de 11 a 13.
La mosca de la fruta Drosophila melanogaster, ha contribuido enormemente a nuestro understanding del desarrollo normal y la enfermedad a través del uso de técnicas genéticas sofisticadas desarrolladas a lo largo de las últimas décadas 14-17. El uso de mutagénesis y herramientas sobreexpresión hemos llegado a una mejor comprensión de diversos oncogenes y genes supresores de tumores 18-22. Sin embargo, la metástasis tumoral es el resultado de la cooperación entre varias lesiones genéticas que se ha estudiado principalmente en modelos de cultivo de células 23,24, así como diversos modelos de xenoinjerto 25-27. Estos modelos aunque poderosa tienen sus limitaciones, ya que no reproducir todas las condiciones que se encuentran en un organismo vivo. Además, los modelos transgénicos disponibles en ratones son engorrosos y no es propicio para el análisis genético de la conducta invasiva 28,29. Varios estudios han intentado entender invasión de células tumorales en Drosophila 30,31. Estas técnicas utilizan principalmente el trasplante de tumores primarios a anfitriones y luego se basan en el seguimiento de la transplanted tumores para la invasión de los tejidos vecinos 32,33. Una poderosa técnica llamada MARCM 10 fue adaptada por Pagliarini y Xu para modelar la invasión tumoral en Drosophila 9. Esta elegante modelado genética de la invasión tumoral explotado la cooperación entre un oncogén activado y la pérdida de la polaridad celular. El poder de este modelado se encuentra en el hecho de que los tumores invasivos se crean en un organismo intacto eludiendo así la necesidad de trasplante de tejidos. Para llevar a cabo la cooperación oncogénica, un oncogén activado como Ras V12 se expresa en los clones de células en el disco de ojos antenal de larvas. Como resultado de la técnica de MARCM estos clones también están marcadas con proteína fluorescente verde (GFP) para la visualización fácil y se hacen homocigotos para los mutantes de la polaridad celular como larvas letal gigante, íntima, y discos grandes. El resultado es GFP etiquetada tumores invasivos en el complejo cefálica. En este informe,demostrar cómo inducir, y visualizar estos tumores invasivos tanto en el contexto de una larvas intacto y en diseccionados complejo cefálica. La inducción de tumores que aquí se presenta utiliza reactivos en el segundo cromosoma de Drosophila. En la Tabla 2, proporciono una lista de acciones en X y 3 ª cromosomas que pueden ser utilizados para el mismo fin. Creo que este protocolo simplificado hará que esta técnica de fácil acceso para los investigadores interesados en la comprensión de la base molecular de la progresión del tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cáncer es una enfermedad compleja con una comprensión mucho mejor hoy que en el pasado. Sin embargo, todavía queda mucho por aprender y explicado antes de que tengamos una imagen completa de los mecanismos subyacentes. El protocolo simple que aquí se presenta permite inducir genéticamente tumores benignos y invasivos en un organismo completo y, a continuación estudiar la biología asociada con la progresión de los tumores en este modelo. La mayoría de las técnicas existentes en Drosophila y otros or…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en mi laboratorio es apoyado por el Departamento de los fondos de inicio Biología WKU, WKU Investigación Fundación RCCA-Concedo # 11-8032 y con una donación KBRIN-AREA financiado mediante una donación de padres, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud con el número premio 5P20GM103436-13. También me gustaría agradecer al Dr. Tian Xu, en cuyo laboratorio se me presentaron a esta técnica y el Dr. Raymond Pagliarini que estableció por primera vez esta técnica en el laboratorio de Xu.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
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