Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов<em> Дрозофилы</em
Summary
Сотрудничество между активированной онкоген как РАН V12 и мутациями в генах клеточной полярности, как написал, приведет к росту опухоли у дрозофилы, когда опухолевые клетки также отображать инвазивных поведения. Вот простой протокол для индукции и наблюдения за доброкачественных и инвазивных опухолей представлена.
Abstract
Drosophila осветил наше понимание генетической основы нормального развития и заболевания в течение последних нескольких десятилетий, и сегодня он продолжает вносят огромный вклад в наше понимание сложных заболеваний 1-7. Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является комплексное мероприятие 8 и был смоделирован у дрозофилы, чтобы помочь нам лучше понять генетическую основу этого заболевания 9. Здесь я представляю простой протокол к генетически индуцировать, наблюдать, а затем анализировать прогрессирование опухолей у личинок дрозофилы. Метод индукции опухолей основана на системе MARCM 10 и использует взаимодействие между активированного онкогена, Рас-V12 и потери генов клеточной полярности (исписанной, диски большой и летальный гигантский личинок) для генерации инвазивных опухолей 9. Я продемонстрировать, как эти опухоли могут быть визуализированы в неповрежденной личинок ито как они могут быть вырезали для дальнейшего анализа. Упрощенная Протокол, представленные здесь, должны сделать возможным для эта техника, которые будут использоваться исследователями, заинтересованных в понимании роли гена в опухолевой инвазии.
Introduction
Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является шагом мудрый процесс, который характеризуется уклонение от защитных механизмов в организме 8. Например опухолевые клетки в организме должны быть в состоянии уйти от апоптоза и иммунную систему, прорыв специализированный внеклеточный матрикс (ECM) под названием базальной мембраны, и преодолеть любые социального контроля, введенные окружающих клеток 8. Именно через шаг мудрого прогрессии, что раковые клетки приобретают способность к миграции и колонизации отдаленных объектов в процессе, называемом метастазы. Наше понимание того, как опухолевая клетка преодолевает барьеры, введенные тела все еще находится в зачаточном состоянии, однако, складывающаяся картина из исследований, проведенных до сих пор указывает на повторном использовании нормальных процессов развития и сигнальных путей по раковых клеток 11-13.
Плодовая муха дрозофилы имеет вносит огромный вклад в нашу ундerstanding нормального развития и болезни за счет использования сложных генетических методов, разработанных в течение последних нескольких десятилетий 14-17. Использование мутагенеза а избыточная экспрессия инструменты мы пришли к лучшему пониманию различных онкогенов и генов-супрессоров опухолей 18-22. Тем не менее, метастазирование опухолей является результатом сотрудничества между несколькими генетических поражений, которые были изучены в первую очередь в клеточных моделях культуры 23,24, а также различные ксенотрансплантата моделей 25-27. Эти модели, хотя мощный имеют свои ограничения, поскольку они не имитировать полностью условиям, имеющимся в живом организме. Кроме того, трансгенные модели доступны у мышей являются громоздкими и не способствует генетического анализа инвазивного поведения 28,29. Несколько исследований пытались понять вторжение опухолевых клеток у дрозофилы 30,31. Эти методы в основном используют трансплантацию первичных опухолей к хостам а затем полагаться на отслеживание траnsplanted опухоли за вторжение в соседние ткани 32,33. Мощная техника называется MARCM 10 была адаптирована Pagliarini и Сюй моделировать опухолевой инвазии у дрозофилы 9. Этот элегантный генетическая моделирование опухолевой инвазии эксплуатировали сотрудничества между активированной онкоген и потери клеточной полярности. Мощность этого моделирования заключается в том, что инвазивных опухолей создаются в здоровом организме, таким образом, обход необходимость трансплантации тканей. Чтобы добиться онкогенного сотрудничества, активированный онкоген как Рас V12 выражается в клонов клеток в личиночной глаз-усиков диска. В результате технике MARCM эти клоны также отмечены зеленого флуоресцентного белка (GFP) для легкой визуализации и сделаны гомозиготных по клеточной полярности мутантов, как летальной гигантских личинок, пометки и дисков больших. В результате GFP помечены инвазивных опухолей в головной комплекс. В этом докладе япродемонстрировать, как вызвать, и визуализировать эти инвазивных опухолей как в контексте интактного личинок и в вырезали головной комплекса. Индукционная опухоль, представленная здесь использует реагенты на втором хромосомы дрозофилы. В таблице 2 я приведу листинг акций на X и 3-м хромосом, которые могут быть использованы для тех же целей. Я считаю, что это упрощенный протокол сделает этот метод легко доступны для исследователей, заинтересованных в понимании молекулярных основ опухолевой прогрессии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рак является сложным заболеванием с гораздо лучшего понимания сегодня, чем в прошлом. Тем не менее, многое еще предстоит узнать и объяснил прежде чем мы имеем полную картину основных механизмов. Простой протокол, представленные здесь делает возможным генетически вызывать доброкачест?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования в моей лаборатории поддерживается WKU кафедры биологии запуска средств, WKU исследовательский фонд RCAP-Я допускаю # 11-8032 и грантом KBRIN-ЗОНА финансируется за счет родительского грант от Национального Института общей медицинских наук Национального института здравоохранения под награда числа 5P20GM103436-13. Я также хотел бы выразить признательность доктору Тянь Сю в лаборатории которого я познакомился с этой техникой и д-р Раймонд Pagliarini который первым установленном эту технику в лаборатории Сюй.
Materials
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |
Referências
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
- Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
- Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
- Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
- Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
- Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
- Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
- Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
- Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
- Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
- Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
- Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genética. 154, 695-712 (2000).
- Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genética. 156, 1231-1242 (2000).
- Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
- Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
- Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
- McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
- Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
- Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
- Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
- Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
- Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
- Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
- Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
- Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genética. 177, 1667-1677 (2007).
- Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).
