Summary
Время курсы для гликозилазу деятельность 8-оксогуанин ДНК гликозилазу являются двухфазные выставке взрыв формирования продукта и линейной стационарной фазы. Использование охлаждение потока техники, взрыв и стационарное показатели могут быть измерены, что соответствует удалению 8-оксогуанин и выпуск гликозилаза от продукта ДНК соответственно.
Abstract
Человеком 8-оксогуанин ДНК-гликозилаза (OGG1) вырезает мутагенных окислительное повреждение ДНК 8-оксо-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) из ДНК. Кинетическая характеристика OGG1 проводится для измерения скорости 8-oxoG иссечение и выпуска продукции. Когда OGG1 концентрации ниже, чем субстратной ДНК, временной ход образование продукта являются двухфазные; быстрый экспоненциальной фазе (т.е. разрыв) образования продукта следует линейной стационарной фазы. Первоначальный выброс образования продукта соответствует концентрации фермента в зацепление на подложке, и взрыв амплитуда зависит от концентрации фермента. Первого порядка константа скорости взрыв соответствует истинный коэффициент 8-oxoG иссечение и медленнее стационарного скорости измеряет скорость выпуска продукта (продукт ДНК константы скорости диссоциации, K OFF). Здесь мы описываем стационарный, предварительно стационарных и одного оборота подходы для выделения и измерения зрecific шаги во OGG1 каталитического велоспорт. Меченных флуоресцентными поражение-содержащий олигонуклеотид и очищенный OGG1 используются для облегчения точного кинетических измерений. Так как низкие концентрации фермента используются для стационарных измерений, ручное перемешивание реагентов и гашение реакции может быть выполнен, чтобы установить стационарные скорости (к выключен). Кроме того, экстраполяция стационарных скоростью до точки на оси ординат в нулевой момент времени показывает, что взрыв образование продукта произошла во время первого оборота (т.е. у-перехват положительна). Первого порядка константа скорости экспоненциальной фазе всплеска может быть измерена с использованием быстрое смешивание и закалки метод, который проверяет объем продукта, полученного на короткие промежутки времени (<1 сек) до стационарной фазы и соответствует скорости 8 -oxoG иссечение (т.е. химии). Химические стадии, может также быть измерена с использованием одного оборота подход, при котором каталитический велосипедепредотвратить насыщение ДНК субстрата с ферментом (E> S). Эти подходы можно измерять элементарных констант скорости, которые влияют на эффективность удаления повреждений ДНК.
Introduction
Аэробной среде спешит геномной нестабильности. Основным promutagenic поражение ДНК в результате окислительного стресса 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxoG). Это связано с неоднозначным кодирования потенциал 8-oxoG. Человека 8-оксогуанин ДНК гликозилазу (OGG1) отвечает за разработку базы репарации 8-oxoG. Гликозилазу деятельности OGG1 акцизов 8-oxoG базы в результате ДНК-продукт с сайта апуриновыми (AP-сайта). Слабую активность лиазы OGG1 можно надрезать AP-сайта в некоторых случаях.
Кинетическая характеристика ДНК гликозилазами вообще считает, что они проявляют двухфазный курсах времени. После начальной фазы быстрого образования продукта (т.е. разрыв), линейный стационарной фазы наблюдается 1-3. Такое поведение является показателем шагом после химии (т.е. конформационных изменений или выпуска продукта), которые лимитирующей при линейной части хода времени, тогда как борй этап, часто упоминается как переходный этап, соответствует образование продукта в активном центре фермента в ходе первого цикла реакции. При выпуске продукта является ограничение скорости во время стационарной фазы, измерения активности обеспечивают качественную меру продукта ДНК-связывающим сродством, но не предоставляют информацию о кинетической событиях в активном центре фермента (например, химия). Таким образом, методы, чтобы изолировать и измерить экспоненциальное предварительно стационарного взрыва фазе необходимо, чтобы исследовать события в течение первых ферментативной оборот в активном 4 центре фермента.
Существуют три стандартных кинетические подходы для характеристики каталитического поведение OGG1 (1) стационарный, (2) предварительно стационарный, и (3) одного оборота. Эти подходы отличаются друг от друга на концентрацию фермента в реакционной смеси и фермента к субстрату соотношение используемой в каждом подходе. В типичной стационарный подходиногда называют несколько кинетика оборота, низкие концентрации фермента, используют для последующей образование продукта. Концентрации субстрата значительно превышает концентрацию фермента, так что несколько ферментативных обороты не оказывают существенного влияния концентрации субстрата. В этой ситуации время курсов должны быть линейными и часто бывает трудно определить, является ли взрыв произошел во время первого оборота из-за низкой концентрации фермента, используемого в данном подходе, обратите внимание, что взрыв амплитуды эквивалентно концентрации фермента. Эту проблему можно решить путем использования более высокой концентрации фермента и экстраполяции линейной курс времени нулевого времени для обнаружения ли первый ферментативный оборот произошло быстро. Отрезок на оси ординат (Y-ось) должна быть пропорциональна концентрации фермента и обеспечивает измерение фермент активно взаимодействует с подложкой. Хотя такой подход может, в принципе свидетельствуют о существовании взрыв фазе дифferent подход необходим для измерения кинетики взрыв фазы. Во многих случаях взрыв фаза слишком быстро, чтобы измерить ручного микширования и методы тушения. В этом случае предварительно стационарных и одного оборота кинетической (т.е. переходных кинетической) приближается часто требуется быстрое смешивание и закалки инструмента следовать ранние моменты времени реакции 5. В предварительно стационарный подход высокие концентрации фермента используются так, что значительное количество продукта образуется во время первого оборота. Поскольку несколько оборотов следуют наблюдать каталитического велосипедные (т.е. линейной фазой, которая следует за разрыв), концентраци субстрата составл ет больше, чем концентрация фермента ([фермент] <[субстрата]). Для выделения событий в активном центре фермента без каталитического езда на велосипеде, одного оборота условиях были использованы. В этом случае подложка пропитана фермента (E >> S) так, чтобы все подложки будет участвовать яN 'одного оборота и, как правило, проявляют одноэкспоненциальный время курса.
Как отмечалось выше, для ферментов, которые демонстрируют взрыв фазе, выпуск продукции (к выключен) часто ограничивает скорость стационарной фазы хода времени. Скорость выпуска продукта (V SS, конц. / Время) может быть определена из наклона линейной стационарной фазы. Концентрация активного фермента (Е), необходимых для преобразования скорости выпуска продукта на внутренние константы скорости где к OFF = V SS / [E]. Важно отметить, что концентрация активного фермента обычно ниже, чем измеренные концентрации белка из-за примесей, неактивный фермент, фермент, не продуктивно связаны с подложкой, и метод, используемый для определения концентрации белка. Концентрация активного фермента может быть определена из пакета, когда амплитуда выпуска продукта идет медленно. Таким образом, экстраполяция стационарных время курсанулевое время дает оценку активного фермента, необходимое для расчета K OFF (выпуска продукции) от наблюдаемых стационарных ставке.
Для измерения кинетики взрыв, предварительно стационарный подход необходимо следовать образование продукта в течение первого оборота, что происходит до линейной стационарной фазы. Взрыв кинетики следует формирование фермента промежуточным продуктом. После Реакцию инициировали путем смешивания фермента с субстратом, количество фермента, продукт резко возрастает, пока реакция не достигает устойчивого фазового состояния. Если катализ происходит намного быстрее, чем выпуск продукта, амплитуда всплеска равна активно участвует фермент и наблюдаемое экспоненциальное приближение к равновесию (к набл) соответствует скорости химическое превращение субстрата в продукт, при условии, что обратная скорость химии является незначительным.
В некоторых случаях каталитического суцепляются мешает предварительного стационарного анализа, такие как, когда величины ставки по химии и выпуска продукции существенно не отличаются. В этом случае, используя относительный избыток фермента к субстрату предотвращает каталитического на велосипеде и пределы подложки связанный с ферментом в один оборот. Таким образом, первый этап химической реакции может быть выделен и точно определены в качестве первого порядка константы скорости (к набл). Это константа скорости должна быть похожа на K набл определяется из предварительного стационарного подхода, описанного выше.
Здесь мы описываем, как эти кинетические подходы могут быть использованы для анализа гликозилаза активность OGG1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление фермента и субстрата ДНК
- Сверхэкспрессируют OGG1 как GST-слитого белка в E. палочка, использовать GST-тегов для очистки, а затем удалить GST-теги расщеплением HRV-3C протеазы (рис. 1) 6.
- Покупка химически синтезированы 5'-6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) меченого олигонуклеотида, содержащих один 8-oxoG остатка и ее комплементарной нити немеченого олигонуклеотида. 34-мерного олигонуклеотида содержать 8-oxoG в положении 17 от 5'-конца. Очищают этих олигонуклеотидов помощью электрофореза в полиакриламидном геле.
- Подготовка двухцепочечной ДНК субстрата, содержащего 8-oxoG путем смешивания 5'-6-FAM меченного олигонуклеотида с комплементарной цепи при молярном соотношении 1:1,2 в отжиг буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА) в 1,5 мл трубки микроцентрифужную. Поместите пробирку в обращении в кипящей воде в течение 5 мин. Оставьте трубку на место, а затем дайте воде медленно остывать до RООМ температуры (это занимает около 2 ч).
- Выполнение подготовки проб и эксперимента при низкой или минимальной освещенности так, чтобы минимизировать фотообесцвечивания флуоресцентной меткой.
2. Измерение стационарного учебного времени и титрование активных Сайт OGG1
2.1. Пробоподготовки и стационарное время конечно
- Подготовка субстрата ДНК и OGG1 решения отдельно в реакционном буфере (50 мМ HEPES, рН 7,5, 20 мМ KCl, 0,5 мМ ЭДТК и 0,1% бычьего сывороточного альбумина) в 1,5 мл пробирок микроцентрифуге на льду. Концентрацию ДНК составляет 400 нМ, и очевидно концентрации OGG1 30, 60, 90 или 120 нМ, как определено с помощью анализа на протеин по Брэдфорду. Поместите реакционных труб в наборе блоков тепла при 37 ° С. Предварительно инкубировать фермента и субстрата ДНК решений отдельно при 37 ° С в течение 1 мин.
- Начало реакции путем смешивания равных объемов растворов OGG1 и ДНК субстрата с помощью пипетки. После смешивания этих решенийных 1:1 (объем / объем), конечная концентрация 200 нМ ДНК и 15, 30, 45 или 60 нМ OGG1 соответственно. Удалить аликвоты (10 мкл) в интервалах времени и гашения реакции путем смешивания с 1 мкл 1 М NaOH. В качестве контроля в течение времени, курсов, 10 мкл реакционной смеси без фермента смешивают с 1 мкл 1 М NaOH.
- Поместите реакции образцов в 90 ° тепла блока С в течение 5 мин, чтобы расщепить полученный продукт AP-сайта. После нагревания добавляют 1 мкл 1 М HCl, чтобы нейтрализовать каждого образца.
- Добавить равный объем (12 мкл) буфера для нанесения геля (95% формамида, 20 мМ ЭДТА, 0,02% бромфенола, и 0,02% ксилолцианола) в каждую реакционную образца, а затем поместить смесь в нагревательный блок установлен на уровне 95 ° C в течение 2 мин, а затем немедленно поместить пробирку на льду.
- Загрузка образцов (5 мкл) на 15% денатурирующего полиакриламидного гель, содержащий 8 М мочевины в 89 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА. Подложка и расщепленные продукты хорошо разделены послеработает геля.
2.2. Визуализация геля
- Сканирование геля с использованием тепловизора, который может обнаружить флуоресцентной меченой ДНК и визуализировать субстрата и продукта полос.
- Количественная полосы после съемки геля. Заметим, что некоторые фона расщепления можно наблюдать после лечения самой подложки с раствором NaOH (Фиг.2А). Вычесть из этого из измеренного количества каждого продукта реакции.
2.3. Анализ данных
- Участок количества продукта, полученного на каждой реакции (т) (фиг. 2В). Анализируют данные, используя уравнение 1 для определения амплитуды разрыва (0, у-перехват) и наклон линейной стационарной фазы (об сс).
- Участоку-перехват по отношению к общей концентрации белка (т.е. очевидно концентрация фермента; фиг.2С), что обеспечивает меру активной фракции фермента. С помощью линейной аппроксимации с нулевым перехвата обеспечить поправочный коэффициент для определения доли активного фермента.
- Участок стационарной скорости по отношению к концентрации активного фермента (рис. 2D), обеспечивающий скорость продукт константа диссоциации (т.е. наклон оборудована линией).
3. Измерение Предварительно стационарное время курса
Как показано на фиг.2, образование продукта во время вспышки фаза является слишком быстро, чтобы измерить ручного микширования и закалки. Таким образом, с резким охлаждением потоком документ может обеспечить мощный метод для измерения быстрых реакций, которые происходят в масштабах миллисекунд времени (рис. 3) 5. В приборе используются управляемые компьютером двигатель быстро перемешатьй утолить реакции после указанного времени реакции. Например, используйте KinTek RqF-3 быстрого охлаждения-Flow прибор для измерения начальной фазы взрыва и последующего стационарного фазе образования продукта катализируемых OGG1. Быстрого охлаждения-Flow инструменты доступны из нескольких производителей.
3.1. Приготовление образца
Отдельно получают субстратной ДНК и OGG1 решений в 1,5 мл пробирки, как описано в 2-1. Концентрации ДНК и активный OGG1 около 400 нМ и 80 нМ, соответственно. Это приводит к конечной концентрации 200 нМ ДНК и 40 нМ активного OGG1 после смешивания 1:1 (об / об).
3.2. Подготовка быстрого охлаждения потока инструмента
- Подключите циркулирующей водяной бане до быстрого охлаждения потока инструмент для контроля температуры (37 ° C).
- Настройте параметры прибора и выберите соответствующую петлю реакции в течение требуемого времени точек в соответствии с инструкциями производителяных. Реакция петли имеют переменную длину, чтобы обеспечить альтернативные времени реакции.
- Подготовка реакционного буфера и NaOH утолить решений в 10 мл Luer Блокировка одноразовые шприцы и приложить эти шприцы Drive Порты и загрузите диск Резервуары с реакционным буфером (шприцы B) и 142 мм NaOH (шприц Q) (шприц смесительные клапаны в положения груза) . Для удаления пузырьков воздуха из шприца, решение работать туда и обратно несколько раз.
- Опустите шагового двигателя до его соприкосновения с верхней части шприца (шприц нагрузки клапанов и клапанов Пример нагрузки в огне положение).
- Промойте Пример Loops, реакционный контур, и выходную линию с водой и метанолом. Высушите раскрасневшиеся районы полностью (клапаны FLUSH положение).
3.3. Предварительно стационарный временной ход
- Сделать отверстие в верхней крышкой 1,5 мл трубки с помощью 16-иглы. Прикрепите трубу на выходе линии для сбора погашенной реакции.
- Установите требуемый reactioN времени (в секундах) с помощью клавиатуры. Шаговый двигатель будет создавать резервные копии для корректировки объема петли так, чтобы поддерживать постоянный объем закалки. Позиция толкатель для шприца B против платформы шагового двигателя, добавив буфер с одноразовыми шприцами, закрепленной на приводе порты.
- Заполнить 1 мл Luer Блокировка одноразовые шприцы с ДНК субстрата и OGG1 решений, соответственно (образец клапана нагрузки положение). Приложить шприцы с субстратной ДНК и OGG1 решения для каждого из портов Пример нагрузки, а затем заполнить Пример петли с субстратной ДНК и OGG1 растворов, соответственно (Образец нагрузки клапанов в НАГРУЗКИ положение).
- Установить все Шприц нагрузки клапанов и клапанов Пример Нагрузка на огневой позиции. Запустить реакцию клавиатуры инсульта (например нажатие "G" или клавиши "СТАРТ"). Субстратной ДНК и OGG1 решений (18 мкл каждый) быстро смешивают в реакции петли.
- Подождите, пока реакция не будет автоматически гасят при желаемой реакции путем смешивания 36 мкл Гeaction смеси с 86 мкл 142 мМ NaOH. После гашения реакции, образец выгружают из выхода линии.
- Установите клапаны Шприц нагрузки в положение нагрузки и нагрузки образца клапанов FLUSH положение. Промойте Пример Loops, реакционный контур, и выходную линию водой и метанолом и высушить, как описано в 3.2. Повторите описанную выше процедуру для каждого момента времени.
- Выполните контрольный эксперимент без фермента для определения поправки на фон, который можно сделать вручную или с быстрой закалки инструмента. Для выполнения управления с быстрым закалки инструмента, заполнить петлю образца ДНК с ДНК субстрата, но держать петлю образца в течение OGG1 пустым. Установите время реакции, выполните смеси и гашение, как описано в 3.3.4-3.3.6.
- Промыть Пример Циклы и реакционного контура с помощью 2 М NaOH, 2 М HCl, водой и метанолом, а затем высушить промытого линий. После установки шагового двигателя в исходное положение, переключите клапаны Шприц нагрузки к нагрузке позиционированиемN и мыть Drive Резервуары с водой.
- Лечить закаленных образцов реакции с теплом, а затем отдельные субстрата и продукта ДНК на 15% денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле, как описано в 2.1.
- Визуализация и количественно полосы на геле, как описано в 2.2.
3.4. Анализ данных
Установите время курсов образования продукта с помощью нелинейного регрессионного анализа для уравнения с экспоненциальным ростом и линейных членов (уравнение 2) предоставление первого порядка константа скорости (к OBS), амплитуда всплеска (0), а Линейная скорость (V SS).
4. Оборот одной временной ход
- Подготовка субстрата ДНК и OGG1 в отдельные пробирки на 1,5 мл, как описано в 2-1. Концентрацииных ДНК и активный OGG1 100 нМ и 500 нМ соответственно, это дает конечные концентрации 50 нМ ДНК и 250 нМ OGG1 после смешивания 1:1 (об / об).
- Подготовьте быстрого охлаждения потока инструмента и получения реакционного образца, как описано в 3.2 и 3.3.
- Лечить закаленных образцов реакции с теплом и подвергать их 15% денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле в отдельной подложке и продуктов, как описано в 2.1.
- Визуализация и количественно полосы на геле, как описано в 2.2.
- Установите время курсов образования продукта в одной экспоненты, чтобы определить первого порядка константа скорости (к OBS) в качестве выражения 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стационарные кинетический анализ проводили с использованием 200 нМ субстратной ДНК и четырех различных концентраций очевидно OGG1 (15, 30, 45 и 60 нМ), как определено с помощью анализа Брэдфорда 2. Время курса образования продукта были пригодны для линейного уравнения для определения у-перехват, которые были 2,2, 11, 15 и 26 нМ, соответственно, по отношению друг к концентрации белка (фиг. 2В). У-перехватывает были дополнительно нанесены относительно друг фактическую концентрацию белка (фиг. 2С). Фракцию активного фермента была определена как 38% от наклона линии на фиг.2С. Для определения стационарной скорости V SS определяется из линейного припадков на фиг.2В были нанесены относительно у-перехватывает (фиг. 2D). Наклон линии на рисунке 2D была 0,0028 сек -1, что эквивалентно константы скорости диссоциациидля продукта AP-сайта и врезанных AP-сайте образованных ДНК гликозилазу / лиазы деятельности.
Предварительного стационарного время курса последовала использованием 200 нМ подложки ДНК и 40 нм активного OGG1. Время курсы образование продукта можно приспосабливать к уравнению с экспоненциальным ростом и линейных членов. Как показано на рисунке 4, к. OBS и К с были признаны 0,75 с -1 и 0,0055 с -1 соответственно 2. Амплитуда всплеска фазе (33 нМ) была несколько ниже, чем предсказано от концентрации активного OGG1 добавления (40 нМ). Это может быть из-за неспецифического связывания OGG1 с ДНК субстрата, который снижает доступное количество молекул фермента.
Под одним оборотом условиях, 8-oxoG иссечение реакция заканчивается в течение 6 с (рис. 5) 2. Временной ход образовании продукта могут быть здоровы одной экспонентыуравнения и принесло к OBS 0,74 с -1. Следует отметить, что амплитуда образование продукта был ниже, чем ожидаемые 50 нМ добавлены ДНК субстрата. Это может быть обусловлено отчасти фон расщепление ДНК NaOH обработки (2А) или наличие неотожженной олигонуклеотидов субстрата в реакционной смеси.
Рисунок 1. Очистка человека OGG1 из E. палочки. OGG1 человеческий ген, клонировали в pGEX-6P-1 и избыточно экспрессируется в BL21 (DE3). Дорожка 1; неиндуцированных клеток, дорожка 2, индуцированных IPTG клетки, дорожка 3; фракции растворимого белка, дорожка 4; глутатион-сефарозе 4B после инкубации с фракции растворимого белка, дорожка 5, поток через колонку фракции после инкубации глутатион-сефарозе 4B с HRV 3C протеазы, переулок, 6; поток через фракции после удаления загрязнений на колонке Mono Q. Фотографию гель, окрашенный кумасси голубым показана.
Рисунок 2. Стационарная кинетика и титрование активного сайта очищенной OGG1 OGG1 2 (15 нм, ○, 30 нМ, □, 45 нМ, ◊, или 60 нм, ×). Инкубировали с 200 нМ ДНК субстрата (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC -3 ', где Х представляет собой 8-oxoG паре с С) при 37 ° С в течение 1-30 мин, как указано. Эти концентрации ферментов представляют собой очевидный концентрации белка на основе анализа Брэдфорда, количественно с кривой BSA стандарта., Денатурирующих полиакриламидных гелей, показывающий разъединенные подложки (S) и продуктов (Р). OGG1 (30 нМ) и 200 нМ D NA подложки был использован для реакции. В, время курсы образования продукта. Эти данные были пригодны для линейного уравнения для определения амплитуды взрыв фазе (у-перехват) и очевидной скоростью выпуска продукта (наклон). С, участок перехватывает определяется из линейного припадков на панели В относительно который определяется с помощью анализа Брэдфорда. Наклон линии соответствует фракции активного фермента. Величина ошибки означает ошибку в амплитуде выведено из линейного подходит для образования продукта в панель B. D, участок склонов определяется из линейного припадков на панели В по отношению к концентрации активного фермента. Величина ошибки означает ошибку в наклоне вытекает из линейной подходит для образования продукта в панель B. Наклон линии соответствует стационарной скорости (K выкл), 0,0028 с -1.
Рисунок 3. Обзор быстрого охлаждения-Flow инструмента.
Рисунок 4. Предварительно стационарной кинетики 8-oxoG вырезание по OGG1 2. OGG1 (40 нМ активного фермента) инкубировали с 200 нМ ДНК субстрата (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', где Х представляет собой 8-oxoG паре с С) при 37 ° С в течение 0-100 с. Пунктирная линия указывает экстраполяции стационарных фаз. Данные были пригодны в пакетное уравнения с амплитудой, равной 33 ± 0,89 нМ, K набл равна 0,75 ± 0,083с -1, V с с равным 0,18 ± 0,018 нМ с -1 и К с равным 0,0055 ± 0,020 с -1.
Рисунок 5. Одноместный кинетика оборот 8-oxoG вырезание по OGG1 2. OGG1 (250 нМ активного фермента) инкубировали с 50 нМ ДНК субстрата (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', где Х представляет собой 8-oxoG в паре с C) при 37 ° С в течение 0-60 сек. Данные были пригодны к одному показательному уравнению с к OBS равна 0,74 ± 0,015 с -1. Пунктирная линия указывает экстраполированы амплитуды (т.е. продукт при бесконечном времени).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кинетическая описанные здесь подходы наметить методы определения элементарных кинетических констант. Если временной ход образование продукта является двухфазным с первой ферментативной оборот, происходящие быстро, то шаг после химии является лимитирующей при последующем каталитическом оборотов. В случае OGG1, первый оборот может быть измерена с использованием высоких концентраций фермента, либо с предельной (S <E) или высокой (S> E) концентрации ДНК. В первом случае, реакцию ограничиваться "одного оборота и обеспечивает меру каталитической скорости в активном центре фермента. В последнем случае нескольких ферментативных обороты оцениваются. Взрыв образование продукта происходит в первые оборот обеспечивает меру химических событие в активном центре фермента, тогда как последующий оборот обеспечивают измерение шаг, который ограничивает каталитического на велосипеде. Кроме того, амплитуда всплеска образование продукта обеспечивает меру активно участвует фермент. Это необходимо знать, чтобы вычислить скорость продукта константа диссоциации от стационарной скорости (K OFF = V SS / E). Для OGG1, выпуск продукции ДНК (то есть продукт ДНК константы скорости диссоциации) ограничивает каталитического езда на велосипеде и ее стационарное скоростью 7,8. Как показано на рисунке 4, ДНК продукта константы скорости диссоциации (K с = 0,0055 с -1) для OGG1 на два порядка величины ниже, чем наблюдаемая скорость каталитической (K набл = 0,75 с -1). Это общая кинетическая функция ДНК гликозилазами что акцизные поврежденных оснований ДНК, чтобы связать свою продукцию (ДНК с сайта лишенного основани звена) плотно, так что выпуск продукта является ограничение скорости в стационарном режиме измерения 1,8-10. Важно отметить, что стационарных измерений деятельности тем самым обеспечить простой и прямой способ определить продукт ДНК-связывающего сродства; низкой активностью предлагает жесткий продукт Binding.
Как описано на фиг.2, и Представитель Результаты, активные фракции фермента определяется как 38%. Активную фракцию ниже, чем определяется из концентрацию белка, даже несмотря на подготовленную фермент> 95% однородным (рис. 1). Это может быть из-за неспецифического связывания фермента с субстратом и / или метод определения белка, который не может точно оценить истинную концентрацию белка (например Bradford анализа белка обычно используют бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта, которые могут быть хорошая имитировать для фермента интереса). Кроме того, концентрация белка может быть определена другими способами или оценены с расчетными молярные коэффициенты экстинкции при 280 нм, такой как разработанный Гилл и фон Хиппель 11.
Как показано на рисунках 4 и 5, величина K набл определяется сюдам предварительно стационарный время курса должны быть совместимы с что определяется из одного оборота эксперимента. Значение К с также должны быть экспериментально последовательным между альтернативных кинетических методов. Если, однако, эти константы скорости различны (например, к выключено отличается между стационарным и предварительно стационарных условиях), различные шаги могут быть измерены каждого метода и новой модели должны быть рассмотрены. Кроме того, ингибирование продукции или подложки истощение может влиять на очевидный стационарный скоростью в заранее стационарный время курса, который загрязняет линейной части.
В ситуации, когда лопаются и стационарной фазы не хорошо разделенными (т.е. к OBS ~ K выключенном состоянии), амплитуда всплеска и наблюдаемым константы скорости являются композиты элементарных констант скорости для нескольких шагов 12. Кроме того, если выпуск продукта является быстрое (т. е. К офф> K OBS), время конечно образования продукта не двухфазный (первый оборот и последующим обороты ограничены одним и тем же шагом, химия). В этом случае одного оборота эксперимент может обеспечить меру катализа.
Если один-оборота подход, предпринимаемая для установления внутренней скорость каталитической, достаточное количество энзима должны быть использованы для обеспечения того, чтобы привязки не частично ограничением скорости. Кроме того, связывание субстрата также должны быть быстрым, так что скорость съемки не ограничена связывания субстрата. Чтобы проверить, что фермент связывания не ограничения скорости в течение одного оборота эксперимент, временной ход повторяется с различной концентрацией фермента, чтобы подтвердить, что экспоненциальный ход времени не изменяется. Кроме того, так как амплитуда ход времени взрыв или одного оборота прямо пропорциональна фермент или субстрат концентрации, соответственно, эти концентрации должны быть выбраны сØ они могут быть надежно оценена. Наконец, следует отметить, что, когда взрыв и стационарный ставки не хорошо разделены, взрыв амплитуда занижает истинную концентрацию активного фермента 12.
Кинетика подходы, описанные выше, обеспечивают надежный способ изолировать ключевые этапы в процессе каталитической велосипедного ДНК-гликозилазы. С помощью этих ссылкой кинетических констант, влияние измененной последовательности ДНК / структура 1,13-18, остатки активного центра 19,20, ион металла 21, или клеточный белок принадлежность по катализу или энзимный цикл теперь могут быть оценены 22-24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Джули К. Хортон за критическое прочтение рукописи и д-р Раджендра Прасад за полезные советы и обсуждения. Части этого исследования были первоначально опубликованы в журнале Biological Chemistry, Sassa ET. др.., "Контекст Последовательности ДНК Воздействие на гликозилаза активности человека 8-оксогуанин гликозилаза ДНК." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Эта работа была поддержана, полностью или частично, Национального института исследований в области здравоохранения грантового проекта Z01-ES050158 в очной программе исследований, NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
- Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
- Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
- Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
- Johnson, K. A.
- Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
- Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
- Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
- Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
- Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
- Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
- Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
- Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
- Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
- Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
- Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
- Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
- Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
- Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
- Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
- Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
- Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
- Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).
