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Chemistry

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Published: August 19, 2013 doi: 10.3791/50695
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Structural Biology, NIEHS, National Institutes of Health

Summary

Zeit Kurse für die glycosylase Aktivität von 8-oxoguanine DNA glycosylase sind zweiphasige ausstellenden ein Platzen der Produkt-Bildung und einer linearen steady-state-Phase. Verwendung Quench-Flow-Techniken, die platzen und die Steady-State-Raten gemessen werden können, die Exzision von 8-oxoguanine und Freisetzung des glycosylase DNA aus dem Produkt entsprechen.

Abstract

Menschliche 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase (OGG1) schneidet das mutagene oxidative DNA Läsion 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) von DNA. Kinetische Charakterisierung OGG1 vorgenommen wird, um die Raten von 8-oxoG Exzision und Produkt-Release zu messen. Wenn die Konzentration niedriger als OGG1 Substrat-DNA ist, sind Zeitverläufe der Produktbildung zweiphasige, eine schnelle exponentielle Phase (dh Burst) der Produktbildung durch einen linearen stationären Phase. Anfängliches Platzen der Produktbildung entspricht der Konzentration des Enzyms auf das Substrat ordnungsgemäß in Eingriff, und der Burst-Amplitude abhängig von der Konzentration des Enzyms. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante des Bursts entspricht der intrinsischen Rate von 8-oxoG Exzision und die langsamere steady-state Inflationsrate misst die Rate der Freisetzung (Produkt DNA Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante, k off). Hier beschreiben wir Steady-State-, pre-steady-state und Single-Turnover-Ansätze zu isolieren und zu messen specific Schritte während OGG1 katalytische Radfahren. A fluoreszenzmarkierte Läsion enthaltenden Oligonukleotid und gereinigt OGG1 werden verwendet, um präzise kinetische Messungen zu erleichtern. Seit niedrig Enzymkonzentrationen verwendet werden, um steady-state Messungen, manuelles Mischen von Reagenzien und Abschrecken der Reaktion machen kann durchgeführt werden, um die steady-state (k off) zu ermitteln. Zusätzlich zeigt Extrapolation der stabilen Frequenz bis zu einem Punkt auf der Ordinate auf Null Mal, dass ein Platzen der Produktbildung in der ersten Umsatz (dh der y-Achse positiv ist) eingetreten ist. Die ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante der exponentiellen Burst-Phase kann unter Verwendung eines schnellen Vermischung und Abschrecken Technik, die die Menge des Produkts, in kurzen Zeitabständen (<1 s) vor der stationären Phase gebildet untersucht und entspricht der Höhe von 8 werden oxoG-Exzision (dh Chemie). Die chemische Schritt kann auch unter Verwendung eines Single-Turnover-Ansatz, wo katalytische Radfahren istverhindert durch Sättigen Substrat-DNA mit dem Enzym (E> S). Diese Ansätze lassen sich messen elementare Geschwindigkeitskonstanten, die die Effizienz der Entfernung von einer DNA-Läsion beeinflussen.

Introduction

Einer aeroben Umgebung beeilt genomische Instabilität. Ein wesentlicher promutagene DNA Läsion aus oxidativem Stress ist 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG). Dies ist aufgrund der mehrdeutigen Codierung Potential 8-oxoG. Menschliche 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) ist verantwortlich für die Initiierung Basenexzisionsreparatur von 8-oxoG. Die glycosylase Aktivität OGG1 schneidet das 8-oxoG Basis resultierende Produkt in DNA mit einer Apurin Website (AP-site). Eine schwache Lyaseaktivität von OGG1 können die AP-Website in einigen Fällen einzuschneiden.

Kinetische Charakterisierung von DNA Glycosylasen allgemein fest, dass sie zweiphasige zeitliche Verläufe aufweisen. Nach einer anfänglichen schnellen Phase der Produktbildung (dh Burst) wird eine lineare stationären Phase beobachtet 1-3. Dieses Verhalten ist, das einen Schritt nach Chemie (dh Konformationsänderung oder Produkt release) ist geschwindigkeitsbestimmend während des linearen Teils der Zeitverlauf, während der Bohrerst Phase, die oft als die transiente Phase bezeichnet, entspricht die Produktbildung in der aktiven Stelle des Enzyms während des ersten Zyklus der Reaktion. Bei Produkt-Release Rate Limiting während der Steady-State-Phase ist, bieten Aktivitätsmessungen eine qualitative Messung der Produkt-DNA Bindungsaffinität, aber keine kinetische Informationen über Veranstaltungen im aktiven Zentrum des Enzyms (dh Chemie). Dementsprechend sind Methoden zu isolieren und messen die exponentielle pre-steady-state Burst-Phase benötigt, um Ereignisse während der ersten enzymatischen Umsatz an das Enzym aktive Zentrum 4 sondieren.

Es gibt drei Standard kinetische Ansätze, um die katalytische Verhalten OGG1 charakterisieren, (1) Steady-State, (2) pre-steady-state, und (3) Single-Turnover. Diese Ansätze unterscheiden sich durch die Konzentration des Enzyms in dem Reaktionsgemisch und dem Enzym zu Substrat-Verhältnis in jedem Ansatz verwendet. In einem typischen Steady-State-Ansatz,manchmal als mehrere Umsatzkinetik bezeichnet werden, sind geringe Konzentrationen von Enzym zur Bildung Produkt folgen. Die Substratkonzentration übersteigt bei weitem die Enzymkonzentration so dass mehrere enzymatische Umsätze nicht wesentlich beeinträchtigen Substratkonzentration. In dieser Situation sollte Zeitverläufe linear sein, und es ist oft schwierig zu erkennen, ob ein Burst in der ersten Umsatz aufgrund der geringen Enzymkonzentration in diesem Ansatz trat; beachten Burstamplitude entspricht der Enzymkonzentration. Dies kann durch Verwendung einer höheren Enzymkonzentration und Extrapolieren der linearen Zeitverlauf auf den Zeitpunkt Null zu erfassen, ob die erste enzymatischen Umsetzung schnell aufgetreten überwunden werden. Der Achsenabschnitt auf der Ordinate (y-Achse) sollte proportional zur Enzymkonzentration und stellt ein Maß für das Enzym aktiv mit dem Substrat in Eingriff. Obwohl dieser Ansatz im Prinzip den Nachweis für die Existenz eines Burst-Phase, und ein DIF-schiedenen Ansatz erforderlich, um die Kinetik der Burst-Phase messen. In vielen Fällen ist der Burst-Phase ist zu schnell, um durch manuelles Mischen und Abschrecken Techniken messen. In dieser Situation nähert sich pre-steady-state und Single-Turnover-kinetische (dh transient kinetische) erfordern oft einen schnellen-mixing und Abschrecken Instrument zu frühen Zeitpunkten einer Reaktion 5 folgen. In einer vorher stationären Ansatz hohe Konzentrationen des Enzyms, so dass eine erhebliche Menge an Produkt in der ersten Umsatzes gebildet werden. Da mehrere Umsätze gefolgt sind katalytische Radfahren (dh die lineare Phase, die die Burst folgt) zu beobachten, ist Substratkonzentration größer als die Enzymkonzentration ([Enzym] <[Substrat]). Um Ereignisse im aktiven Zentrum des Enzyms zu isolieren ohne Katalysator Radfahren, sind Single-Turnover-Bedingungen verwendet. In diesem Fall wird das Substrat mit dem Enzym gesättigt (E >> S), so dass alle von dem Substrat wird i teilnehmenn der "einzigen Umsatz" und wird typischerweise eine Single-exponentiellen Zeitverlauf.

Wie oben für Enzyme, die eine Burst-Phase, Produkt-Release (k off) weisen darauf hingewiesen, begrenzt oft die Geschwindigkeit der Steady-State-Phase des zeitlichen Verlaufs. Die Rate der Freisetzung (v ss, Konz. / Zeit) aus der Steigung der linearen steady-state-Phase bestimmt werden. Die aktive Enzymkonzentration (E) benötigt wird, um die Rate der Produkt-Release einer intrinsischen Geschwindigkeitskonstante konvertieren wo k off = v ss / [E]. Wichtig ist, dass das aktive Enzym-Konzentration in der Regel niedriger als der gemessene Proteinkonzentration durch Verunreinigungen, inaktives Enzym, Enzym nicht-produktiv Substrat gebunden, und die Methode zur Protein-Konzentration bestimmen. Die aktive Enzymkonzentration kann aus dem Burstamplitude bestimmt werden, wenn Produkt-Release ist langsam. So Extrapolation eine steady-state zeitlichen Verlauf zuNull Zeit liefert eine Schätzung der aktiven Enzym benötigt, um k off (Produktversion) aus dem beobachteten steady-state zu berechnen.

Um die Kinetik des Bursts messen, ist ein Pre-Steady-State-Ansatz notwendig, um Produkt-Bildung während der ersten Umsätze, die vor dem linearen stationären Phase tritt folgen. Die Burst-Kinetik folgt die Bildung von Enzym-Zwischenprodukts. Sobald die Reaktion durch Mischen von Enzym mit dem Substrat eingeleitet wird, die Menge an Enzym-Produkt schnell erhöht, bis die Reaktion einen stationären Zustand erreicht Phase. Wenn Katalyse ist viel schneller als Produkt-Release ist die Amplitude des Bursts gleich aktiv engagiert Enzym und dem beobachteten exponentiellen Annäherung an das Gleichgewicht (k obs) entspricht der Geschwindigkeit der chemischen Umwandlung von Substrat zu Produkt, vorausgesetzt, dass das Gegenteil von Chemie vernachlässigbar.

In einigen Fällen katalytischen cyklammern stört mit einem pre-steady-state-Analyse, z. B. wenn die Größen der Preise für Chemie und Produkt-Release sind nicht signifikant unterschiedlich. In diesem Fall, unter Verwendung überschüssigen Enzym relativ zu dem Substrat verhindert katalytische Rad-und Grenzwerte Substrat mit dem Enzym in einem Umsatz gebunden. Dementsprechend kann die erste chemische Schritt der Reaktion isoliert und genau bestimmt als die Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung (k obs). Diese Geschwindigkeitskonstante sollte ähnlich k obs ermittelt aus der pre-steady-state oben beschriebenen Ansatz.

Hier beschreiben wir, wie diese kinetische Ansätze verwendet werden, um die Aktivität von glycosylase OGG1 analysieren.

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Protocol

1. Herstellung des Enzyms DNA-Substrat und

  1. Over-express OGG1 als GST-Fusionsprotein in E. coli, nutzen die GST-tag für die Reinigung, und entfernen Sie dann die GST-tag durch Spaltung mit HRV-3C Protease (Abbildung 1) 6.
  2. Kaufen Sie das chemisch synthetisiert 5'-6-Carboxy-(6-FAM) markierte Oligonukleotid mit einem einzelnen 8-oxoG Rückstand und ihre komplementäre unmarkiertem Oligonukleotidstrang. Die 34-mer-Oligonucleotide enthalten ein 8-oxoG an Position 17 vom 5'-Ende. Reinigen dieser Oligonucleotide durch Polyacrylamidgelelektrophorese.
  3. Bereiten doppelsträngigen DNA-Substrats, das 8-oxoG durch Mischen von 5'-6-FAM markierte Oligonukleotid mit ihren komplementären Strang in einem Molverhältnis von 1:1,2 in Hybridisierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Das Röhrchen in einen Schwimmer in kochendem Wasser 5 min. Lassen Sie den Schlauch an Ort und Stelle und dann lassen Sie das Wasser langsam abkühlen zu room Temperatur (dies dauert ca. 2 h).
  4. Führen Probenvorbereitung und das Experiment unter niedrigen oder minimalen Lichtverhältnissen so zu minimieren Bleichen der Fluoreszenz-Markierung.

2. Messung der Beharrungszustand Zeit Course und Active-Site Titration von OGG1

2.1. Probenvorbereitung und steady-state Zeitverlauf

  1. Bereiten DNA Substrat und OGG1 Lösungen getrennt in Reaktionspuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 20 mM KCl, 0,5 mM EDTA und 0,1% Rinderserumalbumin) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Die Konzentration der DNA ist 400 nm und die scheinbare Konzentration OGG1 30, 60, 90, oder 120 nm, wie durch einen Bradford-Protein-Assay bestimmt. Legen Sie die Reaktionsgefäße in einem Heizblock Satz bei 37 ° C Pre-Inkubation Enzym und DNA-Substrat-Lösungen separat bei 37 ° C für 1 min.
  2. Starten Sie die Reaktion durch Mischen gleicher Volumina der OGG1 und DNA-Substrat-Lösungen durch Pipettieren. Nach dem Mischen diese Lösunggen 1:1 (v / v), sind die Endkonzentrationen 200 nM DNA und 15, 30, 45 oder 60 nM OGG1 sind. Entfernen Aliquote (10 ul) in zeitlichen Abständen und wird die Reaktion durch Mischen mit 1 ul 1 M NaOH. Da die Steuerung für die Zeit-Verläufe, 10 ul des Reaktionsgemisches ohne Enzym wird mit 1 ul 1 M NaOH gemischt.
  3. Die Reaktionsröhrchen Proben in einem 90 ° C Heizblock 5 min zu spalten, das resultierende Produkt AP-Website. Nach dem Erhitzen, fügen Sie 1 ul 1 M HCl, um jede Probe zu neutralisieren.
  4. In das gleiche Volumen (12 ul) Gelladepuffer (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,02% Bromphenolblau und 0,02% Xylencyanol) zu jeder Reaktion Probe, und legen Sie dann die Mischung in einem Heizblock bei 95 ° C eingestellt für 2 min, dann sofort den Schlauch auf Eis.
  5. Laden der Proben (5 ul) auf einem 15% igen denaturierenden Polyacrylamidgel mit 8 M Harnstoff in 89 mM Tris-HCl, pH 8,8, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA und. Das Substrat und die gespaltenen Produkte sind nach abgetrenntAusführen des Gels.

2.2. Imaging des Gels

  1. Scannen Sie das Gel mit einem Imager, der die Fluoreszenz-markierten DNA erkennen und visualisieren das Substrat und Produkt-Bands.
  2. Quantifizierung der Banden nach der Bebilderung das Gel. Beachten Sie, dass einige Hintergrund Spaltung nach der Behandlung des Substrats selbst mit NaOH (2A) beobachtet werden. Subtrahieren diesem Hintergrund aus der gemessenen Menge jedes Reaktionsprodukt.

2.3. Datenanalyse

  1. Zur Erstellung der Menge des Produkts an jedem Reaktionszeit (t) (Fig. 2B) ausgebildet ist. Analysieren der Rohdaten unter Verwendung der Gleichung 1, um die Amplitude des Burst (A 0, y-Achse) und der Steigung der linearen stationären Phase (V ss) zu bestimmen.

  1. Grundstückdie y-Achse relativ zu der Gesamt-Protein-Konzentration (dh ersichtlich Enzymkonzentration, 2C), der ein Maß der aktiven Fraktion des Enzyms. Verwenden Sie eine lineare Anpassung mit Nullachsenabschnitt um den Korrekturfaktor für die Bestimmung des Anteils an aktivem Enzym bereitzustellen.
  2. Zeichnen Sie die Steady-State-Rate relativ zum aktiven Enzym-Konzentration (Abbildung 2D) und bietet das Produkt Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (dh Steigung der angepassten Linie).

3. Messung der Pre-steady-state Zeitverlauf

Wie in 2, Produktbildung während der Burst-Phase gezeigt zu schnell ist, um durch manuelles Mischen und Abschrecken zu messen. Somit kann eine schnelle Quench-Flow-Gerät bieten eine leistungsfähige Methode, um schnelle Reaktionen, die auf die Millisekunde Zeitskala (Abbildung 3) 5 auftreten messen. Das Gerät verwendet einen Computer-gesteuerten Antriebsmotor schnell mischen einnd löschen Reaktionen nach angegebenen Reaktionszeiten. Verwenden Sie zum Beispiel eine Kintek RQF-3 Schnelle Quench-Flow-Instrument, um die anfängliche Burst-Phase und anschließender Steady-State-Phase des Produkt-Bildung durch OGG1 katalysiert messen. Schnelle Quench-Flow Instruments sind von verschiedenen Herstellern erhältlich.

3.1. Vorbereitung der Probe

Gesondert vorbereiten DNA Substrat und OGG1 Lösungen in 1,5-ml-Röhrchen wie in 2-1 beschrieben. Die Konzentrationen von DNA und aktive OGG1 sind 400 nM und 80 nM. Dies führt zu einer Endkonzentration von 200 nM und 40 nM DNA aktiv OGG1 nach dem Mischen 1:1 (v / v).

3.2. Vorbereitung der schnellen Quench-Flow-Gerät

  1. Schließen Sie ein zirkulierendes Wasserbad zur schnellen Quench-Flow-Instrument für Kontrolle der Temperatur (37 ° C).
  2. Stellen Sie die Parameter des Gerätes und wählen die entsprechende Reaktion Schleife für den gewünschten Zeitpunkten nach den Anweisungen des Herstellerstionen. Die Reaktion Schleifen sind von variablen Längen, alternative Reaktionszeiten bieten.
  3. Bereiten Reaktionspuffer und NaOH stillen Lösungen in 10 ml Luer Lock Einmalspritzen und befestigen diese Spritzen, um das Laufwerk Ports und laden Sie die Antrieb Reservoirs mit Reaktionspuffer (Spritzen B) und 142 mM NaOH (Spritze Q) (Spritze Ladeventile in LOAD-Position) . Um die Luftblasen aus der Spritze zu entfernen, funktioniert die Lösung hin und her mehrmals.
  4. Senken Sie den Schrittmotor, bis sie die Spitze der Spritze (Spritze Ladeventile Sample laden Ventile in Position FIRE).
  5. Spülen Sie die Loops, die Reaktion Loop, und die Exit-Linie mit Wasser und Methanol. Trocknen Sie die geröteten Bereiche komplett (Ventile in FLUSH Position).

3.3. Pre-steady-state Zeitverlauf

  1. Machen Sie ein Loch in der Spitze eines verkappten 1,5-ml-Röhrchen mit einer 16-Gauge-Nadel. Bringen Sie ein Rohr an der Ausfahrt Linie um den gestoppten Reaktion zu sammeln.
  2. Stellen Sie die gewünschte reaction Zeit (in Sekunden) über die Tastatur ein. Der Schrittmotor wird eine Sicherungskopie zu for-Schleife Lautstärke so einzustellen, wie konstant Quench Volumen zu halten. Position Kolben für Spritze B gegen den Schrittmotor-Plattform durch Zugabe von Puffer mit den Einwegspritzen, die an den Antrieb Ports.
  3. Füllen Sie 1 ml Luer Lock Einmalspritzen mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen, bzw. (Probenventile in LOAD-Position). Bringen Spritzen mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen für jede der Probenmenge Ports, und füllen Sie dann die Probe Loops mit DNA-Substrat und OGG1 Lösungen bzw. (Sample Load-Ventile in LOAD-Position).
  4. Stellen Sie alle Spritze Ladeventile Sample Ladeventile der FIRE Position. Starten Sie die Reaktion durch eine Tastatur Hub (zB Presse von "G" oder "START"-Taste). DNA-Substrat und OGG1 Lösungen (18 ul pro Stück) werden sofort in der Reaktionsschleife gemischt.
  5. Warten Sie, bis die Reaktion automatisch an der gewünschten Reaktionszeit durch Mischen 36 ul der r abgeschreckteaktion Mischung mit 86 ul 142 mM NaOH. Nach Quenchen der Reaktion wird die Probe aus der Auslassleitung abgeführt.
  6. Legen Sie die Spritze Ladeventile der LOAD-Position und die Probe Ladeventile dem FLUSH Position. Spülen Sie die Loops, die Reaktion Loop, und die Exit-Linie mit Wasser und Methanol und trocknet wie in 3.2 beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Zeitpunkt.
  7. Durchführen einer Kontrollexperiment ohne Enzym, um einen Hintergrund-Korrektur, die von Hand oder mit dem schnellen Abschrecken Instrument durchgeführt werden soll. Um ein Steuerelement mit der S-Quench Instrument durchzuführen, füllen Sie die Sample-Loop für die DNA mit DNA-Substrat aber halten Sie die Sample-Loop für OGG1 leer. Stellen Sie die Reaktionszeit, führen Sie die Mischung und Abschrecken in 3.3.4-3.3.6 beschrieben.
  8. Waschen Sie die Probe Loops und die Reaktion Schleife mit 2 M NaOH, 2 M HCl, Wasser und Methanol und dann trocknen Sie die gewaschene Linien. Nach der Einstellung der Schrittmotor zur Ausgangsposition, schalten Sie die Spritze Ladeventile der LOAD Positionierungn und waschen Sie die Antrieb Stauseen mit Wasser.
  9. Behandeln der abgeschreckten Proben Reaktion mit Hitze und dann getrennten Substrat und Produkt-DNA von 15% denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese, wie in 2.1 beschrieben.
  10. Visualisierung und Quantifizierung der Banden auf dem Gel, wie in 2.2 beschrieben.

3.4. Datenanalyse

Montieren Sie die zeitlichen Verläufe der Produktbildung durch nicht-lineare Regressionsanalyse, um eine Gleichung mit einer steigenden exponentiellen und linearen Terme (Gleichung 2) die Bereitstellung der ersten Ordnung Geschwindigkeitskonstante (k obs), die Amplitude des Bursts (A 0) und eine lineare Geschwindigkeit (v ss).

4. Einzel-Umsatz Zeitverlauf

  1. Bereiten DNA Substrat und OGG1 in separaten 1,5-ml-Röhrchen wie in 2-1 beschrieben. Die Konzentrationgen von DNA und aktive OGG1 sind 100 nm und 500 nM; ergibt dies Endkonzentrationen von 50 nM und 250 nM DNA OGG1 nach dem Mischen 1:1 (v / v).
  2. Bereiten Sie den schnellen Quench-Flow-Gerät und bereiten die Reaktion Proben wie in 3.2 und 3.3 beschrieben.
  3. Behandeln Sie die Proben abgeschreckt Reaktion mit Wärme und unterziehen sie 15% denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf separaten Substrat und Produkte wie in 2.1 beschrieben.
  4. Visualisierung und Quantifizierung der Banden auf dem Gel, wie in 2.2 beschrieben.
  5. Montieren Sie die zeitlichen Verläufe der Produktbildung zu einem einzigen exponentiellen die erster Ordnung (k obs) zu bestimmen, wie in Gleichung 3 gegeben.

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Representative Results

Die Steady-State kinetischen Analyse wurde unter Verwendung von 200 nM DNA Substrat und vier verschiedenen scheinbaren Konzentrationen OGG1 (15, 30, 45 und 60 nm), wie durch einen Bradford-Protein-Assay bestimmt 2 durchgeführt. Die Zeitverläufe der Produktbildung von einer linearen Gleichung, um die y-Achse, die 2,2 waren, 11, 15 und 26 nm, relativ zueinander Proteinkonzentration (2B) zu bestimmen, zu passen. Die y-fängt wurden weiter aufgetragen relativ zueinander tatsächlichen Proteinkonzentration (Abbildung 2C). Der Anteil an aktivem Enzym wurde zu 38% von der Steigung der Geraden in 2C. Um den stabilen Frequenz, v ss aus den linearen Anpassungen in 2B bestimmt zu bestimmen, wurden aufgetragen in Bezug auf die y-Schnittpunkte (Fig. 2D). Die Steigung der Geraden in 2D war 0,0028 s -1, die äquivalent zu der Dissoziationskonstante istfür das Produkt AP-Website und eingeritzten AP-Website von DNA glycosylase / Lyase Aktivitäten gebildet.

A pre-steady-state zeitlichen Verlauf wurde durch Verwendung von 200 nM DNA-Substrat und 40 nM aktiv OGG1 gefolgt. Die Zeitverläufe des Produkts Bildung kann zu einer Gleichung mit steigenden exponentiellen und linearen Glieder passen. Wie in 4 gezeigt ist, k obs und k off bestimmt zu 0,75 sec -1 und 0,0055 s -1 bzw. 2 liegen. Die Amplitude des Burst-Phase (33 nM) etwas geringer als von der Konzentration der aktiven OGG1 hinzugefügt (40 nM) vorhergesagt. Dies kann durch eine unspezifische Bindung von OGG1 auf DNA-Substrat, das die verfügbaren Zahlen von Enzymmolekülen reduziert.

Unter Single-Turnover-Bedingungen wurde die 8-oxoG Excisionsreaktion innerhalb von 6 sec (Abbildung 5) 2 beendet. Der zeitliche Verlauf der Nebenproduktbildung kann zu einem exponentiellen passenGleichung und ergab k obs von 0,74 sec -1. Bemerkenswerterweise war die Amplitude für das Produkt, die niedriger ist als die erwartete DNA-Substrat 50 nM zugegeben. Dies könnte zum Teil auf Hintergrund Spaltung der DNA durch NaOH-Behandlung (2A) oder das Vorhandensein von nicht getemperten Substrat Oligonukleotide in der Reaktionsmischung sein.

Abbildung 1
Abbildung 1. Die Reinigung des menschlichen OGG1 von E. coli. Das menschliche OGG1 Gen wurde in pGEX-6P-1 überexprimiert in BL21 (DE3)-Zellen. Lane 1; induzierten Zellen, Spur 2; IPTG-induzierten Zellen, Spur 3; lösliche Proteinfraktion, Spur 4; Glutathionsepharose 4B nach Inkubation mit löslichen Proteinfraktion, Spur 5; Durchflußfraktion nach Inkubation mit Glutathion-Sepharose 4B HRV 3C-Protease, Spur 6; Durchflußfraktion nach Entfernung von Verunreinigungen durch Mono-Q-Säule. Ein Foto von der Coomassie Blau gefärbten Gel gezeigt.

Abbildung 2
Abbildung 2. Steady-State-Kinetik und aktive Zentrum Titration von gereinigtem OGG1 2 OGG1 (15 nM, ○, 30 nM, □, 45 Nm, ◊; oder 60 nm ×). Wurde mit 200 nM DNA-Substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC inkubiert -3 ', wobei X 8-oxoG mit C gepaart) bei 37 ° C für 1-30 min, wie angegeben. Diese Enzymkonzentration darstellen ersichtlich Proteinkonzentrationen auf einem Bradford-Protein-Assay, einer BSA-Standardkurve quantifiziert basiert. A, denaturierenden Polyacrylamidgelen zeigt vereinzelten Substrate (S) und Produkten (P). OGG1 (30 nm) und 200 nM D NA Substrat für die Reaktion verwendet. B, Zeitverläufe der Produktbildung. Die Daten wurden mit einem linearen Gleichung, um die Amplitude des Burst-Phase (y-Achse) und eine scheinbare Geschwindigkeit der Freisetzung (slope) bestimmt passen. C, Parzelle der Abschnitte von den linearen Anpassungen in Panel B bestimmt relativ zu der ermittelten nach dem Bradford-Assay. Die Steigung der Geraden entspricht der Anteil an aktivem Enzym. Der Fehler bar zeigt den Fehler in der Amplitude abgeleitet von linearen Anpassungen auf das Produkt Bildung in Panel B. D, Grundstück von den Pisten aus den linearen Anpassungen in Panel B relativ zum aktiven Enzym-Konzentration bestimmt. Der Fehler bar zeigt den Fehler in der Steigung abgeleitet von linearen Anpassungen auf das Produkt Bildung in Panel B. Die Steigung der Geraden entspricht der stabilen Frequenz (k off), 0,0028 s -1.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Abbildung 3
Abbildung 3. Übersicht von Rapid Quench-Flow-Instrument.

Fig. 4
Abbildung 4. Pre-Steady-State-Kinetik 8-oxoG Exzision OGG1 2. OGG1 (40 nM aktives Enzym) mit 200 nM DNA inkubiert, (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', wobei X 8-oxoG mit C gepaart) bei 37 ° C für 0-100 sek. Die gestrichelte Linie zeigt eine Hochrechnung der stationären Phase. Die Daten wurden an die Burst-Gleichung mit einer Amplitude gleich 33 ± 0,89 nM, k obs gleich 0,75 ± 0,083 passensec -1, v s s gleich 0,18 ± 0,018 nM sec -1 und k off gleich 0,0055 ± 0,020 sec -1.

Abbildung 5
Abbildung 5. Einzel Umsatzkinetik 8-oxoG Exzision OGG1 2. OGG1 (250 nM aktives Enzym) wurde mit 50 nM Substrat DNA (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', wobei X 8-oxoG mit C gepaart) bei 37 ° C für 0-60 sec. Die Daten wurden an die einzelnen exponentiellen Gleichung mit k obs gleich 0,74 ± 0,015 sec -1 passen. Die gestrichelte Linie gibt den extrapolierten Amplitude (dh Produkt infinite Zeit).

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Discussion

Die kinetischen Ansätze hier beschriebenen Methoden, um einen Überblick über elementare kinetischen Konstanten definieren. Wenn ein Zeitverlauf der Produktbildung ist biphasisch mit der ersten enzymatischen Umsatz auftretenden schnell, dann ein Schritt nach Chemie geschwindigkeitsbestimmenden während anschließende katalytische Umsätze. Im Falle OGG1 kann die erste Umsatz unter Verwendung hoher Konzentrationen Enzym entweder mit Begrenzung (S <E) oder hohen (S> E) DNA-Konzentrationen werden. Im ersten Fall wird die Reaktion in einem "Single-Turnover" beschränkt und liefert ein Maß für die katalytische Rate im aktiven Zentrum des Enzyms. Im letzteren Fall werden mehrere enzymatische Umsätze beurteilt. Das Platzen der Produktbildung, die während der ersten Umsatz liefert ein Maß für die chemische Ereignis an das Enzym die aktive Stelle, während nachfolgende Umsätze ein Maß für den Schritt, der katalytischen Radfahren begrenzt bereitzustellen. Darüber hinaus stellt die Amplitude des Burst der Produktbildung ein Maß aktiv Eingriff Enzym. Dies muss bekannt sein, um das Produkt Dissoziationsratenkonstante Berechnung der stationären Geschwindigkeit (k off = v ss / E) werden. Für OGG1 schränkt die Veröffentlichung von Produkt-DNA (dh Produkt-DNA Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante) katalytische Radfahren und seine steady-state Rate 7,8. Wie in Abbildung 4 dargestellt, ist die DNA-Produkt Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante (k off = 0,0055 sec -1) für OGG1 zwei Größenordnungen geringer als die beobachtete katalytische Rate (k obs = 0,75 s -1). Es ist ein gemeinsames Merkmal der kinetischen DNA Glycosylasen dass Verbrauchsteuern beschädigten DNA-Basen, um ihre Produkte zu binden (DNA mit einer Leerstelle) fest, so dass Produkt-Release Rate Limiting bei stationären Messungen 1,8-10 ist. Wichtig ist, steady-state Aktivität Messungen dadurch eine einfache und unkomplizierte Möglichkeit, Produkt-DNA Bindungsaffinität zu bestimmen; geringere Aktivität schlägt strengere Produkt binding.

Wie in 2 und Repräsentative Ergebnisse beschrieben, wird die aktive Fraktion des Enzyms bestimmt zu 38% betragen. Die aktive Fraktion geringer ist als die von der Protein-Konzentration ermittelt wird, obwohl die hergestellte Enzym> 95% homogen (Abbildung 1). Dies kann auf die nicht-spezifische Bindung des Enzyms auf das Substrat und / oder dem Verfahren der Proteinbestimmung nicht genau abschätzen kann die wahre Proteinkonzentration (zB Bradford-Protein-Assay verwendet typischerweise Rinderserumalbumin als Standard, der nicht sein kann gut imitieren für das Enzym von Interesse). Alternativ wird die Proteinkonzentration durch andere Verfahren bestimmt oder geschätzt von einer berechneten molaren Extinktionskoeffizienten bei 280 nm, wie sie von Gill und von Hippel 11 entwickelt.

Wie in den 4 und 5 gezeigt, die Größe k obs bestimmt herm die pre-steady-state Zeitverlauf sollte im Einklang mit, dass aus einem Single-Turnover-Experiment bestimmt. Der Wert von k off sollte auch experimentell konsistent alternate kinetische Methoden. Wenn jedoch diese Geschwindigkeitskonstanten sind unterschiedlich (z. B. k off unterscheidet zwischen stationären und pre-steady-state-Bedingungen), können verschiedene Schritte bei jeder Methode gemessen werden und ein neues Modell in Betracht gezogen werden. Alternativ können Produkt Hemmung oder Substratentleerung die scheinbare Steady-State-Rate in einem pre-steady-state Zeitverlauf, die den linearen Teil verunreinigt beeinflussen.

In der Situation, in der Burst und die Steady-State-Phasen nicht gut getrennt sind (dh k obs ~ k off), die Amplitude des Bursts und die beobachteten Geschwindigkeitskonstanten Verbundwerkstoffe elementarer Geschwindigkeitskonstanten für mehrere Schritte 12. Darüber hinaus ist, wenn Produkt-Release schnelle (dh k off> k obs), der zeitliche Verlauf der Nebenproduktbildung ist nicht zweiphasig (erste Umsatz und anschließende Umsätze von demselben Schritt beschränkt, Chemie). In diesem Fall kann ein Single-Turnover-Experiment ein Maß der Katalyse.

Wenn ein Single-Turnover-Ansatz durchgeführt, um eine intrinsische katalytische Rate zu bestimmen, muss eine ausreichende Enzym verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Bindung nicht teilweise geschwindigkeitsbestimmend werden. Ebenso muss Substratbindung auch schnell, so dass die Burst-Rate nicht durch Bindung des Substrats begrenzt sein. Um sicherzustellen, dass Enzymbindung ist nicht Rate Limiting während einer Single-Turnover-Experiment wird der zeitliche Verlauf mit einem anderen Enzym-Konzentration zu bestätigen, dass die exponentielle Zeitverlauf nicht verändert wird wiederholt. Darüber hinaus, da die Amplitude des Burst-oder Single-Turnover Zeitverlauf ist direkt proportional zur Enzym oder Substratkonzentrationen bzw. sollten diese Konzentrationen gewählt werden so sie zuverlässig gemessen werden kann. Schließlich sei darauf hingewiesen, dass, wenn die Burst-und Steady-State-Preise sind nicht gut getrennt, die Burstamplitude die wahre aktive Enzymkonzentration 12 unterschätzt werden.

Die Kinetik oben beschriebenen Ansätze bieten eine zuverlässige Methode, um wichtige Schritte bei der katalytischen Zyklus des DNA Glycosylasen isolieren. Mit dieser Referenz kinetischen Konstanten der Einfluss der veränderten DNA-Sequenz / Struktur 1,13-18, können Reste des aktiven Zentrums 19,20 Metallionen 21 oder zellulären zusätzliches Protein an der Katalyse oder Enzymzyklus jetzt 22-24 ausgewertet werden.

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Disclosures

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Julie K. Horton für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Dr. Rajendra Prasad für Anregungen und Diskussionen. Teile dieser Forschung wurden ursprünglich in The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et veröffentlicht. al., "DNA-Sequenz Context Auswirkungen auf die Aktivität von humanem Glycosylase 8-Oxoguanine DNA Glycosylase." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Diese Arbeit wurde unterstützt, im Ganzen oder in Teilen, durch National Institutes of Health Research Project Grants Z01-ES050158 im Interne Research Program, NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG Eurofins MWG Operon 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) Eurofins MWG Operon Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
1 ml BD Luer Lock disposable syringe BD Medical 309628 Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
10 ml BD Luer Lock disposable syringe BE Medical 309604 Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
Equipment
Circulating water bath Any vender
RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument KinTek Corporation Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.
Typhoon Phosphorimager 8600 GE Healthcare Life Sciences Imager from other vendors can be used as well.
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References

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Chemie Biochemie Genetik Molekularbiologie Mikrobiologie Strukturbiologie Chemische Biologie Eukaryota Aminosäuren Peptide und Proteine Nukleinsäuren Nucleotide und Nucleoside Enzyme und Coenzyme Life Sciences (General) Enzymologie schnelle Quench-Flow aktive Zentrum Titration steady-state pre-steady-state Single-Turnover Kinetik Basenexzisionsreparatur DNA glycosylase 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine 8-oxoG Sequenzierung
Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität
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Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D. D., Wilson, S. H. Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity. J. Vis. Exp. (78), e50695, doi:10.3791/50695 (2013).

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