Summary
时间8 - 羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶糖基化酶活性课程双相参展产品的形成和爆发出的线性稳态阶段。利用淬火流技术中，突发和可以测量的稳态速率，分别对应到8 - 羟基鸟嘌呤和释放从产物DNA糖基化酶切除。
Abstract
人类8 - 羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1），切除从DNA诱变氧化性DNA损伤-8 - 氧代-7,8 - dihydroguanine（8-oxoG）。 OGG1动力学特性进行测量8 oxoG切除率和产品发布。当的OGG1浓度的低于底物DNA，产物的形成的时间过程是双相的，随后由一个线性稳态阶段产品形成的快速指数阶段（ 即脉冲串）。产物的形成的初始脉冲串对应的正确啮合在基片上的酶的浓度，和脉冲串的幅度取决于酶的浓度。一阶速率常数的突发对应的内在8 oxoG切除率和速度较慢的稳态测量产品的发行率（产品DNA解离速率常数，k 关闭 ）。在这里，我们描述了稳定状态，稳定状态，单营业额的方法来隔离和测量SPecific步骤在OGG1催化的循环。含病变的荧光标记的寡核苷酸和纯化OGG1是用来方便精确的动力学测量。由于酶浓度低，用来做稳态测量，人工搅拌反应试剂和淬火，可以进行确定的稳态率（K 关闭 ）。此外，外推在零时间，纵轴上的点的稳态速率表明的产物的形成过程中发生一个脉冲串的第一个营业额（ 即 y轴截距为正）。可以测量使用的是快速混合和猝灭技术，检查形成在短的时间间隔（<1秒）之前的稳态阶段的产品的量和对应的速率为8的一级速率常数的指数的脉冲串相位oxoG切除术（化学）。化学步骤也可以使用一个单一的营业额的方法测量催化循环防止饱和底物DNA酶（E> S）。这些方法可以测量的基本速率常数的影响的效率去除的DNA损伤。
Introduction
一个有氧环境加快基因组不稳定。甲的主要promutagenic DNA病变导致的氧化应激是7,8 - 二氢-8 - 羟基鸟嘌呤（8-oxoG）。这是由于8-oxoG的暧昧编码潜力。 8 oxoG发起碱基切除修复负责人8 - 羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）。 OGG1切除8 oxoG基地，导致一个的嘌呤网站（AP站点）产品DNA糖基化酶活性。在某些情况下，一个弱OGG1裂解酶活性可以切割的AP站点。
一般动力学特性的DNA糖基化酶发现，他们表现出双相时间课程。在经过最初的快相产物的形成（ 即脉冲串），观察到的线性稳态阶段1-3。这种行为是表示化学（ 即构象变化或产品释放）过程中的时间过程的线性部分的限速的步骤，而钻针圣相，通常被称为“过渡阶段，在第一个周期的反应产物的形成，可在酶的活性位点相对应。当产品发布速率限制在稳态阶段，活动的测量提供了定性测量产品DNA结合的亲和力，但没有提供有关的酶的活性部位（ 即化学）事件的动力学信息。因此，需要的方法来分离和测量指数的预稳态脉冲串相位探测事件的过程中的第一酶在酶的活性位点4的营业额。
有三种标准的动力学方法OGG1催化行为的特征，（1）稳定状态，（2）预稳定的状态，和（3）单成交。这些方法彼此不同的酶的浓度在反应混合物中的每一种方法中使用的酶底物比。在一个典型的稳态的方法，有时也被称为多周转动力学，使用低浓度的酶按照产物的形成。当底物浓度大大超过酶的浓度，以便多个酶失误不显着影响底物浓度。在这种情况下，时间场应该是线性的，它往往是难以辨别是否发生突发过程中的第一个营业额，由于在这种方法中使用的酶浓度低;注意，脉冲串的幅度是酶的浓度相当于。这是可以克服的，通过使用较高的酶浓度和外推线性时间当然零时间检测是否很快就发生了第一种酶营业额。纵坐标（y轴）上的截距应该是酶的浓度成比例，并提供了一个衡量积极从事与底物的酶。虽然这种方法原则上可以提供证据的存在突发阶段，DIFferent方法需要测量的动力学突发阶段。在许多情况下，的突发阶段是太快了人工搅拌淬火技术测量。在这种情况下，预稳态和单营业额动能（ 即瞬态动能）的方法往往需要快速混合和猝灭反应5按照早的时间点的仪器。在一个稳定状态前的方法，使用高浓度的酶，以便在第一个营业额，形成显着数量的产品。 ，由于多个失误其次观察催化循环（ 即突发如下的线性相位），底物浓度是大于酶浓度（[酶] <[基板]）。隔离事件的酶的活性部位无催化单车，单营业额的条件下被使用。在这种情况下，底物是饱和的酶（E >> S），以使所有的基片将参加我在单笔成交金额，通常会表现出一个单一的指数的时间过程。
如上所述酶表现出一个突发阶段，产品发布（K掉 ）往往限制的稳态阶段的时间过程的速率。产品放行的速度（V SS，浓/时间）可确定从斜坡的线性稳态阶段。活性酶浓度（E）产品发布的速度是需要转换的内在速率常数K掉 = V SS / [E]。重要的是，活性酶的浓度一般低于所测得的蛋白浓度因杂质，处于非活动状态的酶，酶的非生产性基板结合，和所使用的方法，以确定蛋白浓度。活性酶的浓度可以由突发幅度当产品释放缓慢的。因此，推断一个稳定状态的时间当然要零时间提供了一个估计需要从观察到的稳态率计算K掉 （产品发布）的活性酶。
要测量的动力学的突发，预稳态的方法是在第一营业额前发生的线性稳态阶段，要遵循产品的形成。该突发动力学如下酶产品的中间体的形成。一旦反应过程是由酶与底物混合的酶产品的量迅速增加，直至反应达到稳定状态阶段。如果催化比产品的发布更迅速，脉冲串的幅度是等于积极参与的酶和所观察到的指数接近平衡（十一观测值 ）对应的底物向产物的化学转化率，假设反向速率化学是可以忽略不计。
在某些情况下催化CY保鲜干扰预稳态分析，如化学和产品发布率的幅度并不显着不同。在这种情况下，采用酶相对过剩防止绑定到一个单一的营业额酶的催化循环和限制基板基板。因此，第一化学反应步骤可以分离和精确地确定作为一级反应速率常数（k 观测值 ）。此速率常数为k应该是相似的OBS从上述预稳态的方法确定。
这里，我们描述如何将这些动力学的方法，可以用来分析OGG1糖基化酶活性的。
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Protocol
1。酶和DNA底物的制备
- 过作为GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达OGG1 大肠杆菌 ，利用GST标签进行净化，然后取出GST标签裂解HRV-3C蛋白酶（ 图1）6。
- 购买化学合成的5'-6-羧基（6-FAM）标记的寡核苷酸包含一个8 oxoG残留和互补未标记的寡核苷酸链。的34聚体寡核苷酸的5'-末端的17位中包含一个8-oxoG。这些寡核苷酸，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
- 准备含有8-oxoG混合5'-6-FAM标记的寡核苷酸，其互补链在退火缓冲液（1的10mM的Tris-HCl，pH值7.5，50 mM氯化钠，以摩尔比为1:1.2的双链DNA基板1mM EDTA）中，在1.5毫升微量离心管中。试管置于一个浮在沸水中5分钟。离开管到位，然后让水慢慢冷却到r的OOM温度（约需2小时）。
- 执行下的实验样品的制备和低的或最小的光照条件下，以尽量减少光漂白的荧光标记。
2。测量稳态的时间进程和活跃的网站滴定OGG1
2.1。样品制备和稳态时间过程
- 准备另外DNA底物和OGG1解决方案，在反应缓冲液（50mM的HEPES，pH值为7.5，20mM的氯化钾，0.5mM的EDTA，0.1％牛血清白蛋白）在1.5ml微量离心管中，在冰上。 DNA的浓度为400纳米和OGG1的表观浓度为30，60，90，或120纳米，由Bradford蛋白测定法确定。放置在一个热块集的反应管在37℃下预孵育的酶和DNA底物溶液，分别在37℃，持续1分钟。
- 通过移液的OGG1和DNA底物溶液等体积混合，开始反应。在混合这些解决方案之后：蒸发散1:1（体积/体积），终浓度是200 nM的DNA和15，30，45，或60 nM的OGG1分别。的时间间隔取出等分试样（10微升），并用1微升的1M NaOH中混合淬灭反应。作为控制的时间过程，10μl的反应混合物中不添加酶混合，用1微升的1M NaOH中。
- 反应样品放置在90℃的加热块为5分钟，以裂解所得产物AP现场。加热后，加入1μl1 M盐酸中每个样品。
- 加入等体积（12微升）的凝胶加样缓冲液（95％甲酰胺，20mM的EDTA，0.02％溴酚蓝，0.02％二甲苯青），每个反应样品中，然后将混合物在95℃下在一个热块2分钟，然后立即将管置于冰上。
- 将样品（5微升）到15％的变性聚丙烯酰胺凝胶，含有8M尿素，89 mM的Tris-盐酸，pH为8.8，89 mM的硼酸，2 mM的EDTA。基片和切割的产品是完全分离后运行凝胶。
2.2。凝胶成像
- 扫描成像器，可以检测出荧光标记的DNA，和可视化的底物和产物的条带的凝胶。
- 量化频带成像后的凝胶。请注意，可能会观察到一些背景裂解后用NaOH（ 图2A），衬底本身的治疗。从测得的各反应产物的量中减去当前背景。
2.3。数据分析
- 绘制形成的产物的量，在每个反应时间（t）（ 图2B）。分析使用公式1来确定的突发（A 0，y轴截距）的幅度和斜率的线性稳态阶段（V SS）的原始数据。
- 情节y轴截距相对于总蛋白浓度（ 即表观酶浓度; 图2C），以提供一定程度的酶的活性级分。使用零截距的线性拟合与提供的校正因子，用于确定分数的活性酶。
- 绘制的稳态速率与活性酶的浓度（ 图2D），提供产品的解离速率常数（ 即拟合直线的斜率）。
3。测量前稳态时间课程
在图2中所示，产物的形成过程中色同步信号相位的测量通过手动搅拌和淬火速度太快。因此，快速冷却流量仪表可以提供一个功能强大的方法来衡量快速反应，发生在毫秒时间尺度（ 图3）5。该仪器采用计算机控制驱动电机迅速混合ND解渴指定的反应时间后的反应。例如，使用一个王技RQF-3快速淬火流量仪表来衡量最初的爆发阶段和后续产品形成催化OGG1稳态阶段。快速淬火流量仪表可从几个厂家。
3.1。样品的制备
单独准备在1.5ml管2-1中所描述的DNA底物和OGG1解决方案。的DNA的浓度和活性OGG1是400纳米和80纳米。这将导致在最终浓度为200 nM DNA和40 nM的后：混合1:1（体积/体积）的活性OGG1。
3.2。的快速淬火流量仪表的制备
- 将循环水浴快速淬火温度控制流量仪表（37°C）。
- 根据制造商的指示，调整仪器参数，并选择适当的反应循环所需的时间点蒸发散。反应循环可变长度提供备用的反应时间。
- 准备反应缓冲液和NaOH淬火解决方案鲁尔锁10毫升的一次性注射器，这些注射器连接到驱动器端口，并加载驱动油藏反应缓冲液（注射器B）和142毫米氢氧化钠（注射器Q）（注射器负载负荷位置阀门）要去除气泡的注射器，工作的解决方案，来回几次。
- 下步进电机，直到它接触的注射器（注射器负载阀和样品负载阀在FIRE位置）的顶部。
- 冲洗样品定量，反应的循环，并用水和甲醇的线出口。干燥潮红领域完全（阀门FLUSH位置）。
3.3。预稳态时间过程
- 具有上限的1.5毫升管使用16号针头的顶部的一个孔。号线出口连接管收集淬火反应。
- 设置所需的reaction个时间（秒）使用键盘。步进电机将备份到调整循环量，从而保持恒定淬火体积。位置通过加入缓冲驱动端口连接到一次性注射器，注射器的柱塞B对步进电机平台。
- 填写1毫升鲁尔锁一次性注射器DNA底物和OGG1解决方案，分别为（取样阀，负载位置）。将DNA底物的注射器和OGG1解决方案的每个样品负载端口，然后填写DNA底物的循环和OGG1解决方案的样品，分别为（样品负载负载位置的阀门）。
- 将所有注射器负载阀和样品负载阀的火位置。由键盘冲程（ 例如，“G”或“启动”键按下）开始反应。 DNA底物和OGG1溶液（各18微升）立即混合在反应循环。
- 等待，直到自动骤冷该反应所需的反应时间，通过混合36微升的reaction 86微升的142毫米NaOH的混合物。终止反应后，将样品从线出口排出。
- 设置注射器负载阀的负荷状况及样品负载阀冲洗位置。冲洗样品定量，反应的循环，并用水和甲醇的线出口，并干燥3.2中所描述的。重复上述步骤，每个时间点。
- 执行未加酶的对照实验，以确定背景校正，可以手动完成，或与快速骤冷的文书。要进行快速淬火仪器控制，填写DNA与DNA底物的样品环，但保持样品环OGG1空。设置了反应时间，进行混合并淬火3.3.4-3.3.6中所描述的。
- 循环和样品反应循环与2 M 2 M氢氧化钠，盐酸，水和甲醇洗涤，然后干燥洗涤后的线。步进电机的设置到起始位置后，切换阀门注射器负载的负载的定位n和洗涤水驱油藏。
- 治疗与热骤冷的反应样品，然后15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，如2.1中描述的独立的底物和产物的DNA。
- 2.2中所描述的可视化和量化的频带上的凝胶。
3.4。数据分析
适合的时间过程的产品形成具有上升指数和线性的条件（公式2）提供的一级反应速率常数（k“ 观测值”），脉冲串的振幅（A 0）的方程，通过非线性回归分析以线性速率（V SS）。
4。单周转时间课程
- 在单独的1.5 ml微量离心管中制备DNA底物和OGG1 2-1中所描述的。浓度DNA和活性OGG1蒸发散分别为100纳米和500纳米，这产生最终浓度为50nM的DNA混合后，1:1（体积/体积）和250 nM的OGG1。
- 准备快速淬火流量仪表，并准备反应样本中所描述的3.2和3.3。
- 治疗用热和骤冷的反应样品使其受到15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离底物和产物，如2.1中所述。
- 2.2中所描述的可视化和量化的频带上的凝胶。
- 适合的时间过程的产品形成一个单一的指数来确定，如在式（3）给出的一级速率常数（k 观测值 ）。
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Representative Results
稳态动力学分析是由使 用200纳米的DNA底物和四种不同浓度明显OGG1（15，30，45和60纳米）确定通过Bradford蛋白检测2。时间课程适合产品形成一个线性方程来确定y轴截距，分别为2.2，11，15，和26纳米，分别相对于每个蛋白浓度（ 图2B）。的y截距，进一步绘制相对于每个实际的蛋白质浓度（ 图2C）。从图2C中的线的斜率，被确定为38％的活性酶的馏分。要确定的稳态速率，V SS从图2B中的线性拟合确定的绘制相对的y轴截距（ 图2D）。图2D中的线的斜率是0.0028秒-1，这是相当于解离速率常数该产品AP现场和阴刻AP的平整DNA糖基化酶/裂解酶的活动。
其次是使用200纳米的的DNA基板和40纳米活跃OGG1预稳态的时间当然。可以适当的产品形成的时间课程与上升的指数和线性方程。 如图4所示，K 观测值和k 关被确定为0.75秒-1和0.0055秒-1，分别为2。 （33 nm）的色同步信号相位的振幅略低于OGG1加入（40 nm）的活性的浓度预测。这可能是由于OGG1的非特异性结合到DNA底物，酶分子数量减少了可用的。
单营业额的条件下，在6秒之内（ 图5）2 8-oxoG切除反应结束。产物的形成的时间过程中，可以在适当的单指数方程和K表 OBS 0.74秒-1产生。值得注意的是，产品的产品形成的振幅低于预期50nM的附加的DNA底物。这可能是部分原因是由于背景裂解的DNA，用NaOH处理（ 图2A）或在反应混合物中的未退火的底物寡核苷酸的存在下。
图1。从大肠杆菌人类OGG1纯化大肠杆菌人类OGG1基因被克隆到pGEX-6P-1和过度表达在BL21（DE3）细胞。巷1号;未诱导细胞，泳道2，泳道3 IPTG诱导细胞;可溶性蛋白质部分，泳道4谷胱甘肽琼脂糖4B孵化后可溶性蛋白质部分，泳道5;流过分数的谷胱甘肽琼脂糖4B孵化后HRV 3Ç蛋白酶，6车道;流经部分去除污染物后，由单音Q柱。考马斯亮蓝染色凝胶的照片显示。
图2。孵育200纳米DNA底物（5'-CTGCAGCTGATGCGCC的X TACGGATCCCCGGGTAC的稳态动力学和积极的现场滴定 OGG1 的纯化OGG1 2。（15纳米，○30纳米，□45纳米，◊或60纳米，×） -3'，其中，X是8 oxoG与C配对），在37℃下1-30分钟。这些酶浓度相当于一个的BSA标准的曲线从一个Bradford蛋白测定，定量的基础上的表观蛋白质含量，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的基片（S）和产品（P）。 OGG1（30纳米）和200纳米ð NA基板被用于该反应，产物的形成的时间进程。适合使用的数据的线性方程来确定色同步信号相位（y截距 ）的振幅和表观速率（斜率）的产品的发布：C，相对于所确定的图确定在面板B的线性拟合的截距通过Bradford法。 线的斜率对应到该级分的活性酶。误差棒表示从线性拟合推断产物的形成，在操作面板B，D，图面板B相的活性酶浓度的线性拟合确定的道的振幅的误差。误差棒表示从线性拟合的斜率推断产物的形成在面板B中的错误。 直线的斜率对应的稳态率（K掉 ），0.0028秒-1。
图3。快速淬火流量仪表概述。
图4。 8-oxoG切除前稳态动力学了OGG1 2。OGG1（40 nM的活性酶）与200 nM的DNA底物（5'-CATGGGCGGCATGAACC的培养所述 GAGGCCCATCCTCACC-3'，其中X为8 oxoG与C配对）在37°C为0-100秒。虚线表示稳态阶段的推断。数据适合突发方程幅度等于33±0.89纳米，K OBS等于0.75±0.083秒-1，V S S等于0.18±0.018纳米秒-1和k 关等于0.0055±0.020秒-1。
图5。 8 oxoG切除单周转动力学了OGG1 2。OGG1（250 nM的活性酶）在37℃培养用50nM的DNA底物（的5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3'，其中X为8 oxoG与C配对） C 0-60秒。数据适合单指数方程有k OBS等于0.74±0.015秒-1。虚线表示推断的幅度（ 即产品在无限的时间）。
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Discussion
动力学这里描述的方法，概括的方法来定义基本的动力学常数。如果一个时间过程的产品形成了第一种酶营业额迅速发生双相，然后经化学的一个步骤是在随后的催化失误限速。 OGG1的情况下，可以使用高浓度的酶与限制（S <E)或高(S>É）DNA的浓度测量的第一个营业额。在第一种情况下，该反应是有限的“单一营业额，并提供一定程度的酶的活性位点的催化速率。在后者的情况下，被评估多种酶失误。产物的形成发生在第一个营业额的突发化学事件提供了一个衡量的酶的活性位点，而随后的失误提供了一个度量的步骤，以限制的催化循环。此外，振幅的突发产物的生成提供了一定程度的积极参与的酶。这必须是已知的，以计算产品的解离速率常数（K掉 = V SS / E）的稳态速度。 OGG1产品DNA（ 即产品DNA解离速率常数）的限制，释放催化循环及其稳态率7,8。在图4中所示的DNA产物的解离速率常数（K 过 = 0.0055秒-1）OGG1两个数量级低于所观察到的催化速率（十一观测值 = 0.75秒-1）。它是一种常见的动力学特征，消费受损的DNA碱基的DNA糖基化酶结合自己的产品（DNA脱碱基部位）紧紧地，使该产品的发布速率限制在稳态测量1,8-10。更重要的是，稳态活性测定，从而提供了一个简单而直接的方法来确定产品的DNA结合亲和力较低的活动提出更严格的产品Binding。
图2代表结果中所描述的，酶的活性馏分被确定为38％。将活性级分低于确定的蛋白浓度，即使在制备的酶是> 95％的均匀的（ 图1）。这可能是由于酶的非特异性结合到衬底和/或蛋白质的测定方法，可能不能准确评估真正的蛋白质浓度（ 例如 Bradford蛋白测定法通常使用牛血清白蛋白作为一种标准，它可能不是一个良好的模拟酶的）。另外，蛋白质浓度可以通过其他方法来确定或估计从计算出的，如开发的吉尔和von Hippel 11在280nm处的摩尔消光系数。
如图所示4和5，k的大小的观测值确定来回米稳态前的时间当然应该是一致的，从一个单一的营业额实验确定。 K 过的值也应该是实验之间交替的动力学方法相一致。然而，如果这些速率常数是不同的（ 例如，K掉是稳定状态和预稳态条件之间的不同），不同的步骤可通过每个方法进行测量，并应被视为一个新的模型。或者，产物抑制或底物耗尽影响的表观稳态速率，在一个稳定状态前的时间过程污染的线性部分。
在突发和稳态阶段的情况下，没有得到很好的分离（ 即k 观测〜K 掉 ），振幅的脉冲串和所观察到的速率常数是复合材料的基本速率常数的多个步骤12。此外，如果产品的发行迅速（关闭 即k> K OBS）产品形成过程，时间是没有双相（第一营业额及随后的失误限制相同的步骤;化学）。在这种情况下，一个单一的营业额的实验可以提供一定程度的催化作用。
如果一个单一的营业额的方法进行确定的特性的催化速率，必须使用足够的酶，以确保绑定部分的速率限制。同样地，基体的结合也必须快，所以，并不限于底物结合的爆率。为了验证酶结合速率限制在一个单一的营业额的实验，不同的酶浓度，以确认指数的时间当然是没有改变的时间过程重复进行。此外，由于脉冲串或单营业额的时间过程的振幅成正比酶或底物浓度的，这些浓度应选择小号Ø他们能够可靠地计量。最后，应该指出的是，当突发和稳态率都不能很好地分离，突发幅度低估了真正的活性酶的浓度为12。
上述动力学方法提供了可靠的方法来分离DNA糖基化酶的催化循环过程中的关键步骤。有了这些参考的动力学常数，活性位点残基19,20，金属离子21日 ，或催化细胞辅助蛋白或酶循环改变DNA序列/结构1,13-18的影响，现在可以进行评估22-24。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢朱莉·霍顿博士批判性阅读的手稿和拉金德拉·普拉萨德博士有用的建议和讨论。这项研究最初发表在杂志“生物化学佐佐A 等部分。人，“DNA序列背景效应的糖基化酶活性的人8 -羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶。”J Biol Chem的 287，36702-36710（2012）2。这项工作是支持的全部或部分，由美国国立卫生研究院资助计划Z01-ES050158，NIEHS院内研究计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software | ||
References
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