Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Published: August 19, 2013 doi: 10.3791/50695
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Laboratory of Structural Biology, NIEHS, National Institutes of Health

Summary

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

Abstract

İnsan 8-oxoguanine DNA glikosilaz (OGG1) DNA mutajenik oksidatif DNA lezyon 8-okso-7 ,8-dihidroguanin (8-oxoG) excises. OGG1 kinetik karakterizasyonu 8-oxoG eksizyon ve ürün sürümü oranları ölçmek için yapılmaktadır. OGG1 konsantrasyonu yüzey DNA daha az olması durumunda, ürün oluşum zamanlı kurslar bifaziktir, ürün oluşumunun hızlı bir üstel faz (yani patlama) doğrusal kararlı durum faz takip eder. Ürün oluşumunun ilk patlama alt tabaka üzerinde düzgün bir şekilde yapan enzim konsantrasyonu karşılık gelir ve patlama genlik enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Patlama sürekli birinci dereceden 8-oxoG eksizyon içsel oranı karşılık gelir ve yavaş kararlı durum oranı ürün sürümü (sürekli ürün DNA ayrışma oranı, k kapalı) oranını ölçer. Burada, kararlı durum, öncesi kararlı durum ve tek cirosu yaklaşımlar sp izole etmek ve ölçmek için tarifOGG1 katalitik devir esnasında ecific adımları. Bir floresan etiketli lezyon içeren bir oligonükleotit ve saflaştırılmış OGG1 hassas Kinetik ölçümleri kolaylaştırmak için kullanılır. Düşük enzim konsantrasyonları kararlı durum ölçümleri, reaksiyon reaktiflerin karıştırma manuel ve soğutma yapmak için kullanılan bu yana kararlı durum oranı (k off) tespit etmek için yapılabilir. Ayrıca, sıfır zamanda ordinat üzerinde bir noktaya kararlı durum oranı ekstrapolasyon ürün oluşumu bir patlama ilk sermaye (yani y-kesişim pozitif) sırasında oluştuğunu gösterir. Üslü kayma fazı sürekli birinci dereceden kararlı durum faz önce kısa zaman aralıklarında (<1 saniye) de elde edilen ürünün miktarını inceler ve 8 hızına karşılık gelen bir hızlı karıştırma ve soğutma tekniği kullanılarak ölçülebilir -oxoG eksizyon (yani kimya). Katalitik bisiklet olduğu kimyasal adım, aynı zamanda, bir tek ciro yaklaşım kullanılarak ölçülebilirenzim (E> S) ile doyurarak substrat DNA ile önlenebilir. Bu yaklaşımlar bir DNA lezyonun çıkarılması verimliliğini etkileyen temel hız sabitleri ölçebilirsiniz.

Introduction

Aerobik ortam genomik istikrarsızlık hızlandırır. Oksidatif stresten kaynaklanan önemli bir promutagenic DNA lezyon 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-oxoG) 'dir. Bu 8-oxoG en belirsiz kodlama potansiyelinin kaynaklanmaktadır. İnsan 8-oxoguanine DNA glikozilaz (OGG1) 8-oxoG baz eksizyon onarımı başlatmak için sorumludur. OGG1 glikozilaz aktivitesi apurinic sitesi (AP-sitesi) ile ürün DNA ile sonuçlanan 8-oxoG tabanı özel tüketim vergilerine. OGG1 Zayıf bir liyaz aktivite bazı durumlarda AP-sitesi insizyon olabilir.

DNA glikolazdan kinetik karakterizasyonu genelde bifazik zamanlı kurslar sergi bulur. Ürün oluşumu bir ilk hızlı faz (yani patlama) sonra, doğrusal kararlı durum faz 1-3 görülmektedir. Bu davranış, bur ise, kimya (yani yapısal bir değişiklik veya ürün ayırma) arasında, zaman akışının lineer kısmı boyunca oran-sınırlayıcı olma aşağıdaki bir aşama göstergesidirgenellikle geçiş fazı olarak adlandırılan faz st, birinci reaksiyon döngüsü sırasında, enzim aktif bölgesinde ürün oluşumuna tekabül eder. Ürün sürümü kararlı durum aşamasında sınırlama oranı olduğunda, aktivite ölçümleri ürün DNA bağlanma afinitesi niteliksel bir ölçü sağlar, ancak enzim aktif bölge (yani kimya) de olaylarla ilgili kinetik bilgi vermemektedir. Buna göre, üstel öncesi kararlı durum patlama faz izole etmek ve ölçmek için yöntemler enzimin aktif bölge 4 ilk enzimatik devir sırasında olayları araştırmak için gereklidir.

(1) kararlı durum, (2) öncesi kararlı durum ve (3) tek cirosu OGG1 katalitik davranışını karakterize etmek için üç standart kinetik yaklaşım vardır. Bu yaklaşımlar, reaksiyon karışımı içinde enzim konsantrasyonu ve her bir yaklaşımda kullanılan substrat oranı için enzim tarafından birbirinden farklıdır. Tipik bir kararlı durum yaklaşımda,bazen birden devir kinetik olarak adlandırılan, enzimin düşük konsantrasyonlarda ürün formasyonu takip etmek için kullanılır. Birden fazla enzimatik kaybı önemli alt tabaka konsantrasyonu etkilemez böylece substrat konsantrasyonu büyük ölçüde Enzim konsantrasyonu aşmaktadır. Bu durumda, zaman içerisinde doğrusal olmalıdır ve bir patlama bu yaklaşımda kullanılan düşük enzim konsantrasyonu nedeniyle ilk devir sırasında meydana gelen olmadığını ayırt etmek zordur; not genlik kayma Enzim konsantrasyonu eşdeğer olduğunu. Bu daha yüksek bir enzim konsantrasyonu kullanılarak ve ilk enzimatik cirosu hızla oluştu olup olmadığını tespit etmek için sıfır zaman doğrusal zaman ders extrapolating aşılabilir. Ordinat üzerinde kesişim noktası (y-ekseni), enzim konsantrasyonu ile orantılı olması ve aktif alt-tabaka ile enzimin yapan bir ölçüsünü sağlar gerekir. Bu yaklaşım, ilke olarak, bir kayma fazı varlığı için kanıt, dif sağlayabilir rağmenlara yaklaşım kayma fazı kinetiğini ölçmek için gereklidir. Birçok durumda patlama aşamasında el karıştırma ve soğutma teknikleri ile ölçmek için çok hızlı. Bu durumda, ön-kararlı durum ve tek cirosu kinetik (yani geçici kinetik) genellikle reaksiyon 5 erken zaman noktalarında takip etmek bir hızlı karıştırma ve soğutma cihazı gerektirir yaklaşır. Bir ön-kararlı durum yaklaşımda enzimin yüksek konsantrasyonlarda ürünün önemli bir miktarı, ilk devir sırasında oluşacak şekilde kullanılır. Birden fazla cirolar katalitik bisiklet (yani patlama aşağıdaki doğrusal faz) gözlemlemek için takip olduğundan, substrat konsantrasyonu enzim konsantrasyonu ([enzim] <[yüzey]) daha büyüktür. Katalitik binme olmadan, enzimin aktif bölgesinde olayları izole etmek için, tek devir koşulları kullanılmaktadır. Bu durumda, alt-tabaka alt-tabakanın tüm i katılacak şekilde (E >> S) enzimi ile doymuşn 'tek cirosu' ve genellikle tek üstel zaman tabii sergileyecek.

Bir kayma fazı, ürün serbest (k off) sergileyen enzimler için yukarıda belirtildiği gibi çoğu zaman akışının kararlı durum faz hızını sınırlar. Ürün sürümü (v ss, kons. / Saat) oranı doğrusal kararlı durum faz eğimi tespit edilebilir. Aktif enzim konsantrasyonu (E) sabit bir iç Oranı ürün sürümü oranını dönüştürmek için gerekli olduğu k off = v ss / [E]. En önemlisi, aktif enzim konsantrasyonu kirleri nedeniyle ölçülen protein konsantrasyonu, etkin enzim, enzim olmayan üretken bir substrata bağlı ve protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılan yöntem, genellikle daha düşüktür. Ürün serbest yavaş olduğunda, aktif enzim konsantrasyonu patlama genlik belirlenebilir. Böylece, bir kararlı durum zaman tabii extrapolatingsıfır zaman gözlenen kararlı durum oranı k off (ürün sürümü) hesaplamak için gerekli aktif enzim bir tahmin sağlar.

Kaymasının kinetiği ölçmek için, bir ön-kararlı durum yaklaşım doğrusal kararlı-durum faz önce meydana gelen ilk devir esnasında ürün oluşumunu takip etmek gereklidir. Patlama kinetik enzim ara ürünün oluşumu izler. Reaksiyon alt-tabaka ile enzimin karıştırma başlatılır Reaksiyon tamamlandıktan sonra sabit bir durum faz ulaşana kadar, enzim-ürününün miktarı hızla artmaktadır. Kataliz çok daha hızlı bir ürün serbest fazla ise, kayma genliği varsayarak, ürün substratm kimyasal dönüştürme hızına karşılık gelen denge aktif yapan enzim ve gözlemlenen üslü yaklaşım (k OBS) eşit olan bir tam tersi oranı kimya ihmal edilebilir düzeydedir.

Bazı durumlarda katalitik cysarılmak gibi kimya ve ürün sürümü için oranları büyüklükleri önemli ölçüde farklı değil olduğu gibi bir ön-kararlı durum analizi, müdahale. Bu durumda, yüzeye aşırı enzim göre istihdam tek bir ciroya enzim ile bağlı katalitik bisiklet ve sınırları yüzey önler. Birinci derece hız sabiti (K OBS) Buna göre, birinci reaksiyon kimyasal adım izole edilebilir ve daha doğru bir şekilde tespit edilmiştir. Bu oran sabit bir atıl k benzer yukarıda tarif edilen ön kararlı hal yaklaşımdan belirlenmelidir.

Burada bu kinetik yaklaşımlar OGG1 glikozilaz etkinliği analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Enzim ve DNA Yüzey hazırlanması

  1. E. bir GST-füzyon proteini olarak aşırı ifade OGG1 coli, saflaştırma için GST-tag, uygulanması ve daha sonra, HRV-3C proteaz (Şekil 1) 6 ile bölünme ile GST-tag çıkarın.
  2. Tek 8-oxoG kalıntı içeren kimyasal olarak sentezlenmiş 5'-6-carboxyfluorescein (6-FAM) etiketli oligonükleotid ve tamamlayıcı etiketsiz oligonükleotid iplikçik satın alın. 34-mer oligonükleotid 5'-ucundan 17 pozisyonunda bir 8-oxoG içerir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile, bu oligonükleotitler arındırın.
  3. Tavlama tamponu 1:1.2 arasında bir mol oranında (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 1 onun tamamlayıcı dizi karıştırma 5'-6-FAM etiketli oligonükleotid tarafından yapılmış 8-oxoG içeren çift-sarmallı DNA substrat hazırlama 1.5 ml mikrofüj tüpüne mM EDTA). 5 dakika için kaynayan su içinde yüzen ise tüp yerleştirin. R yavaş yavaş su soğumasını bekleyin sonra yerde tüp bırakın veoom sıcaklığı (bu yaklaşık 2 saat sürer).
  4. Floresan etiket Photobleaching en aza indirmek için çok düşük ya da çok az ışık koşulları altında numune hazırlama ve deney yapın.

2. Durağan Durum gün Dersin ve OGG1 Aktif Sitesi titrasyonu ölçümü

2.1. Örnek hazırlama ve kararlı durum zamanlı kurs

  1. Buz üzerinde 1.5 ml mikrofüj tüplerine (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCI, 0.5 mM EDTA ve% 0.1 sığır serum albümini), reaksiyon tamponu içinde ayrı ayrı DNA alt tabaka ve OGG1 çözümler hazırlayın. DNA konsantrasyonu 400 nM ve OGG1 belirgin konsantrasyonu, 60 30 olan, 90 ya da 120 nM bir Bradford protein deneyi ile tayin edilmiştir. 37, bir ısıtma bloğu grubu olarak reaksiyon tüpleri ° C 37 ile ön inkübe, enzim ve alt tabaka ayrı ayrı DNA çözümler ° C 1 dakika boyunca kurutuldu.
  2. Pipetleme OGG1 ve DNA substrat çözeltileri, eşit hacimlerde karıştırılarak reaksiyon başlar. Bu çözüm karıştırma sonrasılar 1:1 (h / h), son konsantrasyon 200 nM DNA ve 15, 30, 45 ya da 60 nM OGG1, sırasıyla. Zaman aralıklarında alikotları (10 ul) çıkarın ve 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılarak reaksiyon soğutun. Zaman içerisinde, enzim olmadan reaksiyon karışımı, 10 ul için bir kontrol 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılır gibi.
  3. Yanlması için 5 dakika elde edilen ürün, AP-sitesi için bir 90 ° C ısıya blok içindeki reaksiyon örnekleri yerleştirin. Isıtmadan sonra, her bir numune nötralize etmek için 1 M HCl 1 ul.
  4. Her reaksiyon için örnek jel yükleme tamponu eşit bir hacmi (12 ul) (% 95 formamid, 20 mM EDTA,% 0.02 bromofenol, ve% 0.02 ksilen cyanol) ekleyin ve daha sonra 95 ° C'de ayarlanmış bir ısıtma bloğu karışım yerleştirmek 2 dakika boyunca, daha sonra buz üzerinde hemen tüp yerleştirin.
  5. 89 mM Tris-HCI, pH 8.8, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, 8 M üre içeren% 15'lik bir denatüre edici poliakrilamid jel üzerine numuneleri (5 ul) yükleyin. Yüzey ve bölünmüş ürünleri de sonra ayrılırjel çalışıyor.

2.2. Jelin Görüntüleme

  1. Floresan etiketli DNA tespit ve yüzey ve ürün grupları oluşturulabiliyor bir kamera kullanarak jel tarayın.
  2. Görüntüleme jel sonra bantları sayısal. Bazı arka plan bölünme NaOH (Şekil 2A) ile yüzeye kendisinin tedaviden sonra görülebilir unutmayın. Her bir reaksiyon ürününün ölçülen miktarından Bu arka plana çıkartır.

2.3. Veri analizi

  1. Her reaksiyon süresi (T) (Şekil 2B) oluşan ürün miktarı çizilir. Patlama (A 0, y-kesişim) ve doğrusal kararlı durum faz (v ss) eğimi genliği belirlemek için Denklem 1 kullanarak ham veri analiz edin.

  1. Arsa, enzimin aktif fraksiyonu bir ölçü temin edilmesi; y kesişim toplam protein yoğunluklarının (Şekil 2C, yani belirgin Enzim konsantrasyonu) göre. Aktif enzim fraksiyonu için düzeltme faktörü sağlamak için bir sıfır kesme ile doğrusal bir uyum kullanın.
  2. Ürün ayrılma oranı sabitesi sağlayan, aktif enzim konsantrasyonu (Şekil 2B) göre sabit durum oranı alanı (takılmış hattı yani eğim).

3. Ön kararlı durum gün Dersin ölçümü

Şekil 2'den görüleceği gibi, kayma aşamasında ürün oluşumu gösterilmektedir Elle karıştırma ve soğutma ile ölçmek için çok hızlıdır. Bu nedenle, hızlı bir söndürme-akış alet milisaniye zaman ölçeği (Şekil 3) 5 meydana hızlı reaksiyonlar ölçmek için güçlü bir yöntem sağlayabilir. Cihaz hızla karıştırmak için bir bilgisayar kontrollü tahrik motoru kullanırnd belirtilen reaksiyon süreleri sonra reaksiyonlar gidermek. Örneğin, ilk patlama faz ve OGG1 tarafından katalize ürün oluşum sonraki kararlı durum faz ölçmek için bir KinTek RQF-3 Hızlı Soğutma-Akış Enstrüman kullanın. Hızlı Soğutma-Akış Instruments çeşitli üreticilerin mevcuttur.

3.1. Örnek hazırlanması

Ayrı 2-1 açıklandığı gibi 1,5 ml tüpler DNA substrat ve OGG1 çözümler hazırlar. DNA ve aktif OGG1 konsantrasyonları, sırasıyla, 400 nM ve 80 nM. 200 nM son DNA konsantrasyonu ve 40 nM karıştırma 01:01 (v / v) sonrasında aktif OGG1 ile sonuçlanır.

3.2. Hızlı söndürme akış alet hazırlanması

  1. Sıcaklık kontrolü için hızlı söndürme akış Aracı (37 ° C) bir dolaşan su banyosu bağlayın.
  2. Cihaz parametrelerini ayarlamak ve istenilen zaman için uygun reaksiyon döngü seçin üreticinin talimatlarına göre işaretlar. Reaksiyon döngüler alternatif reaksiyon süreleri sağlamak için değişken uzunlukları vardır.
  3. Reaksiyon tamponu hazırlayın ve NaOH 10 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör çözümler gidermek ve Sürücü Limanlar bu şırınga takın ve reaksiyon tamponu (şırınga B) ve 142 mM NaOH (şırınga Q) (YÜK konumda Şırınga Yük Vanalar) ile Sürücü Rezervuarlar yük . şırınga gelen hava kabarcıklarını çıkarmak için, birkaç kez ileri geri çözüm çalışır.
  4. Step motor indirin temas şırınga üst (YANGIN konumda Şırınga Yük vana ve örnek Yük vanalar) kadar.
  5. Örnek Döngüler, Reaksiyon Döngü, ve su ve metanol ile Çıkışı Hat yıkayın. Tamamen kızarmış alanlar (FLUSH konumunda vanalar) kurutun.

3.3. Ön kararlı durum zamanlı kurs

  1. 16 ölçek iğne kullanılarak bir şapkalı 1.5 ml tüp üst kısmında bir delik açın. Söndürülen reaksiyon toplamak için Çıkışı Hat bir tüp takın.
  2. İstenen reactio ayarlamatakımını kullanarak N süre (saniye olarak). Sabit söndürme hacmi korumak olarak Step Motor çok döngü ses ayarlamak için yedekler. Sürücü Limanlar bağlı tek şırınga ile tampon ekleyerek Step Motor platformu karşı şırınga B için pozisyon pistonları.
  3. DNA substrat ile 1 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör ve OGG1 çözümleri, sırasıyla (YÜK konumda örnek vanalar) doldurun. Örnek Yük Limanlar her birine DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile şırınga takın, ve sonra (YÜK konumda örnek Yük Vanalar) sırasıyla, DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile örnek Döngüler doldurun.
  4. YANGIN konumuna tüm Şırınga Yük Vanalar ve örnek Yük Vanalar ayarlayın. Bir tuş takımı inme ("G" veya "START" tuşuna basın örneğin) ile reaksiyon başlar. DNA yüzey ve OGG1 çözümleri (18 ul her biri) hemen Reaksiyon döngü karıştırılır.
  5. Reaksiyon otomatik olarak R 36 ul karıştırılarak istenen reaksiyon zamanında söndürülmüş kadar bekleyin142 mM NaOH ile 86 ul eaction bir karışım. Söndürme Reaksiyon sonra, numune çıkış hattına boşaltılır.
  6. YÜK konumu ve FLUSH konumuna Örnek Yük Vanalar için Şırınga Yük Vanalar ayarlayın. Örnek Döngüler, reaksiyon döngü ve su ve metanol ile çıkış hattına yıkayın ve 3.2 'de tarif edildiği gibi kurutun. Her noktası için yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
  7. Elle ya da hızlı söndürme aleti ile yapılabilir bir arka plan düzeltmesi belirlemek için enzim olmayan bir kontrol deneyi gerçekleştirin. Hızlı söndürme aleti ile bir kontrol gerçekleştirmek için, DNA substrat ile DNA için örnek döngü doldurmak ama OGG1 boş için örnek döngü tutun. Reaksiyon süresi ayarlamak, karışım yapmak ve gibi 3.3.4-3.3.6 açıklandığı quench.
  8. 2 M NaOH, 2 M HCI, su ve metanol ile birlikte Örnek Döngüler ve reaksiyon döngü yıkayın ve daha sonra yıkanmış hatları kurutun. Başlangıç ​​konumuna Step Motor ayarladıktan sonra, YÜK positio için Şırınga Yük Vanalar geçişn ve su ile Sürücü Rezervuarlar yıkayın.
  9. Daha sonra, söndürülen reaksiyon ısı örnekler ve 2.1 'de tarif edildiği gibi poliakrilamid jel elektroforezi, denatüre edici% 15 oranında ayrı bir substrat ve ürün DNA tedavi edin.
  10. Görselleştirmek ve 2.2 'de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir.

3.4. Veri analizi

Sürekli birinci dereceden (k atıl), patlama (A 0) genliği sağlayan yükselen bir üstel ve doğrusal açısından (Eşitlik 2) ile bir denkleme doğrusal olmayan regresyon analizi ile ürün oluşum zamanlı kurslar Fit ve doğrusal bir oranı (v ss).

4. Tek cirosu gün Dersin

  1. 2-1 de tarif edildiği gibi ayrı bir 1.5 ml tüpler DNA alt tabaka ve OGG1 hazırlayın. KonsantrasyonDNA ve aktif OGG1 lar, sırasıyla, 100 nM ve 500 nM; verimi bu karışım 01:01 (v / v) sonra en az 50 nM ve 250 nM DNA OGG1 son konsantrasyonları.
  2. Hızlı söndürme akış alet hazırlamak ve 3.2 ve 3.3 'de tarif edildiği gibi reaksiyon, numunelerin hazırlanması.
  3. Isı ile Söndürülmüş tepkime örnekleri tedavi ve 2.1 'de tarif edildiği gibi% 15 ayrı substrat ve ürünler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile karşı karşıya bırakmaktadır.
  4. Görselleştirmek ve 2.2 'de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir.
  5. Denklem 3'te verilen birinci dereceden hız sabiti (k atıl) belirlemek için tek bir üstel ürün oluşumu zamanlı kurslar takın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kararlı durum kinetik analizi, bir Bradford protein deneyi 2 ile belirlenen 200 nM DNA alt tabaka ve OGG1 dört farklı görünen konsantrasyonları (15, 30, 45 ve 60 nM) kullanılarak gerçekleştirildi. Ürün oluşumu süresi içerisinde 2.2 idi y kesişim noktası, 11, 15, ve her bir protein konsantrasyonuna (Şekil 2B) göre, sırasıyla 26 nM, belirlemek için bir doğrusal eşitliğe oturtuldu. Y yakaladığını ayrıca, her biri gerçek protein konsantrasyonu (Şekil 2C) göre grafiği çizilmiştir. Aktif enzim kısmını Şekil 2C çizgi eğiminden% 38 olduğu tespit edildi. Kararlı hal hızı, Şekil 2B'de doğrusal uyan belirlenir Vss belirlemek için y yakaladığını (Şekil 2B) göre grafiği çizilmiştir. Şekil 2B içinde hattın eğimi sabit ayrılma oranı eşdeğerdir 0.0028 saniye-1, olduğuÜrün için AP-site ve kazıma AP-sitesi DNA glikozilaz / liyaz faaliyetlerinden kurdu.

Bir ön-kararlı durum zaman süreci 200 nM DNA alt tabaka ve OGG1 aktif 40 nM izledi. Ürün oluşum zamanlı kurslar yükselen üstel ve doğrusal şartları ile bir denklem için uygun olabilir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, atıl k ve k, kapalı 0.75 saniye-1 ve 0.0055 saniye-1, 2 olduğu tespit edilmiştir. Kayma fazı (33 nM) için genliği (40 nM) ilave edilir, aktif OGG1 konsantrasyonu tahmin edilenden biraz daha düşüktü. Bu enzim moleküllerinin sayısı azalır mevcut DNA substrata OGG1 spesifik olmayan bağlanma bağlı olabilir.

Tek cirosu koşullar altında, 8-oxoG eksizyon reaksiyon 6 saniye (Şekil 5) 2 içinde bitirildi. Ürün oluşum zaman ders tek bir üstel için uygun olabilirsn -1 0,74 atıl k denklemi ve vermiştir. Özellikle, ürün oluşumu için genlik beklenen 50 nM DNA substrat eklenir daha düşüktü. Bunun nedeni, kısmen, NaOH-muamele (Şekil 2A) ya da reaksiyon karışımı içinde Tavlanmamış substrat oligonükleotitlerin mevcudiyetinde göre DNA arka yarılmaya bağlı olabilir.

Şekil 1
Şekil 1. E. insan OGG1 saflaştırılması coli. insan OGG1 gen pGEX-6P-1 içine klonlandı ve BL21 (DE3) 'hücrelerinde aşın eksprese edildi. Şerit 1, indüklenmemiş hücreleri, şerit 2, IPTG ile uyarılmış hücreleri, şerit 3, çözünür protein fraksiyonu, şerit 4, çözünür protein fraksiyonu, şerit 5 ile inkübasyondan sonra glutatiyon Sefaroz 4B; HRV 3 glutatiyon Sefaroz 4B inkübasyonundan sonra fraksiyon akışProteaz C, şerit 6, Mono Q kolonu ile kirletici maddelerin çıkarılmasından sonra fraksiyon geçebilir. Coomassie mavisi ile boyanmış jel bir fotoğrafı gösterilmektedir.

Şekil 2,
Şekil 2. Kararlı durum kinetik ve OGG1 2 saflaştırılmış aktif bölge titrasyonu OGG1 (15 nM, ○, 30 nM, □, 45 nM, ◊; veya 60 nM, ×). 200 nM DNA substrat (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC ile inkübe edildi -3 ', X belirtildiği gibi 8-oxoG 1-30 dakika 37 ° C'de) C ile eşleştirilmiş olduğu. Bu enzim konsantrasyonu, bir standart eğriden BSA nicelendirildi Bir ​​Bradford protein deneyi esas protein konsantrasyonlarını temsil eder. Bir ayrıldı, substrat (S) ve ürünleri (P) arası poliakrilamid jeller denatüre. OGG1 (30 nM) ve 200 nM D NA substrat reaksiyonu için kullanıldı. B, ürün oluşumu Zaman içerisinde. Veriler kayma fazı, (y-kesişim noktası) ve ürün serbest bırakma (eğim) arasında belirgin bir hızı genliği belirlenmesi için doğrusal bir eşitliğe oturtuldu. C, Panel B doğrusal uyan belirlenir yakaladığını Arsa belirlenen göreli Bradford yöntemi ile. Grafiğin eğimi, aktif enzim fraksiyonu karşılık gelir. Buradaki hata çubuğu doğrusal uyar ikinci panel B. D, aktif enzim konsantrasyonuna nisbetle Panel B doğrusal uyan belirlenir yamaçları Plot, ürünün oluşumuna olayla genliği hata gösterir. Hata çubuğu doğrusal uyan gelen paneli B ürün oluşumuna anlaşılmaktadır eğim hata gösterir. Çizgisinin eğimini kararlı durum oranı (k off), 0.0028 sn -1 karşılık gelir.

jove_content "fo: keep-together.within-page =" her zaman "> Şekil 3,
Şekil 3,. Hızlı Soğutma-Akış Enstrüman genel bakış.

Şekil 4,
Şekil 4. OGG1 2 ile 8-oxoG eksizyon öncesi kararlı durum kinetiği. OGG1 (40 nM aktif enzim) 200 nM DNA substrat ile inkübe edildi (5'-CATGGGCGGCATGAACC X GAGGCCCATCCTCACC-3 ', X 8-oxoG C ile eşleştirilmiş olduğu) 37 0-100 saniye ° C. Noktalı çizgi, kararlı durum faz bir ekstrapolasyon gösterir. Veriler 0.75 eşit 33 eşit bir genlik ± 0.89 nM, k atıl ile patlama denklemine uygun edildi ± 0.083sn -1, v s s 0.0055 kapalı eşit 0.18 ± 0.018 nM sn -1 ve k eşit ± 0.020 sn -1.

Şekil 5,
Şekil 5,. OGG1 2-8-oxoG eksizyon Yalnız devir kinetiği. OGG1 (250 nM aktif enzim), 37, 50 nM DNA alt tabakası (5'-CTGCAGCTGATGCGCC X TACGGATCCCCGGGTAC-3 ', X 8-oxoG C ile çiftlenenlere olduğu) ile enkübe edilmiştir 0-60 saniye boyunca kurutuldu. Veriler 0.74 eşit k atıl ile tek üstel denklem ± 0.015 sn -1 için uygun bulundular. Noktalı çizgi çıkarım genlik (sonsuz zamanda yani ürün) gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kinetik yaklaşımlar temel kinetik sabitleri tanımlamak için yöntemler ana hatlarıyla burada açıklanan. Ürün oluşumu, bir zaman süreci ilk enzimatik devir hızla meydana gelen iki fazlı ise, kimya sonra bir adım daha sonra katalitik devirleri sırasında oran-sınırlayıcı. OGG1 durumunda, birinci devir ya da (S <E) veya (S> e yüksek) DNA konsantrasyonları sınırlayıcı yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak ölçülebilir. İlk durumda, reaksiyon, bir 'tek-ciro' sınırlıdır ve enzimin aktif bölgesinde katalitik oranını bir ölçüsünü sağlar. İkinci durumda, birden fazla enzimatik kaybı değerlendirilir. Daha sonra top katalitik döngü sınırlar adım bir ölçüsünü sağlar ise ilk devir sırasında meydana gelen ürün oluşumu patlama, enzimin aktif bölgesinde kimyasal olay bir ölçüsünü sağlar. Buna ek olarak, ürün oluşumu patlama genliği aktif yapan enzim bir ölçüsünü sağlar. Bu kararlı durum hızı (k off = v ss / E) tarafından sürekli ürün ayrışma oranını hesaplamak için bilinmesi gerekir. OGG1 için, ürün DNA (yani ürün DNA ayrışma hız sabiti) salınımını katalitik bisiklet ve kararlı durum oranı 7,8 sınırlar. Şekil 4'te gösterildiği gibi, OGG1 için DNA ürün ayrılma oranı sabiti (K = 0.0055 saniye-1 kapalı) gözlenen katalitik oranı (k atıl = 0.75 saniye-1) 'den daha düşük büyüklükte iki işlemlerdir. Bu tüketim hasarlı DNA bazları sıkı çok ürün sürümü kararlı durum ölçümleri 1,8-10 sırasında sınırlayıcı oranı olduğu (bir abasic site ile DNA) ürünlerini bağlamak için DNA'nın glikolazdan ortak bir kinetik özelliktir. Önemli olan, kararlı durum aktivite ölçümleri böylece ürün DNA bağlanma afinitesi belirlemek için basit ve kolay bir yol sağlar; düşük aktivite sıkı ürün b göstermektedirinding.

Şekil 2 ve Örnek Sonuçlar tarif edildiği gibi, enzimin aktif fraksiyonu% 38 olarak tespit edilmiştir. Aktif fraksiyonu hazırlanan enzim>% 95 homojen (Şekil 1) olduğu halde, protein konsantrasyonu belirlenir daha düşüktür. Bu alt tabaka ve / veya doğru bir şekilde (örneğin, Bradford protein deneyi genellikle bir olmayabilir, standart olarak sığır serum albümini kullanan gerçek protein konsantrasyonunun değerlendirilmesi olmayabilir, protein tayini için açıklanan yöntemle enzimin spesifik olmayan bağlanma nedeniyle olabilir iyi) ilgi enzim için taklit. Alternatif olarak, protein konsantrasyonu diğer yöntemlerle belirlenen ya da Gill ve von Hippel 11 tarafından geliştirilen bu kadar 280 nm bir hesaplanan molar yok katsayıları tahmin edilebilir.

Şekillerde gösterildiği gibi, 4 ve 5, K büyüklüğünü atıl ileri belirlenirm öncesi kararlı durum zaman tabii ki tek cirosu deney belirlenir ile tutarlı olmalıdır. K off değeri de alternatif kinetik yöntemler arasında deneysel olarak tutarlı olmalıdır. Bununla birlikte, bu oran sabitleri farklı olması durumunda (örneğin, k off kararlı durum ve ön durağan hal koşulları arasında farklıdır), farklı adımlar her yöntem ile ölçülebilir ve yeni bir model olarak kabul edilebilir olmalıdır. Alternatif olarak, ürün inhibisyonu veya substrat tükenmesi doğrusal kısmı kirlenmektedir önceden kararlı durum zaman içerisinde oluşan belirgin kararlı durum oranı etkileyebilir.

Patlama ve kararlı durum aşamaları iyi (yani k atıl ~ k kapalı) ayrılmış değildir durumda, patlama genliği ve gözlenen hız sabitleri birden fazla adım 12 için temel oranı sabitleri bileşiklerdir. Ayrıca, eğer ürün sürümü (hızlıdıryani k kapalı> k atıl), ürün oluşum zaman ders bifazik değildir (ilk ciro ve sonraki ciroları aynı adım sınırlıdır; kimya). Bu durumda, tek bir devir deney kataliz bir ölçüsüdür sağlayabilir.

Tek bir iç devir yaklaşım katalitik oranını belirlemek amacıyla ise, yeterli bir enzim kısmen hız sınırlama değildir bağlama sağlamak için kullanılması gerekmektedir. Aynı şekilde, bağlayıcı tabaka da o kadar hızlı çekim hızı tabaka bağlanması ile sınırlı değildir, bu olmalıdır. Bu enzim bağlayıcı tek cirosu deney sırasında sınırlayıcı oranı değil doğrulamak için, zaman ders üstel zaman ders değişmiş değildir onaylamak için farklı bir enzim konsantrasyonu ile tekrarlanır. Patlama veya tek devir süresini tabii genliği sırasıyla enzim ya da alt tabaka konsantrasyonu ile doğrudan orantılı olduğundan, buna ek olarak, bu konsantrasyonlar in seçilmelidironlar güvenilir biçimde ölçülebilmesi o. Son olarak, patlama ve kararlı durum oranlarının iyi ayrılmış olmadığı durumlarda, patlama genlik gerçek aktif enzim konsantrasyonu 12 hafife unutulmamalıdır.

Kinetik yaklaşımlar DNA glikolazdan katalitik devir esnasında önemli adımlar izole etmek için güvenilir bir yöntem olarak yukarıda açıklanan. Bu referans kinetik sabitleri ile, değiştirilmiş DNA sekansı / yapı 1,13-18 etkisi, etkin alan artıklarından 19,20, metal iyonu 21 ya da kataliz veya enzim bisiklet hücresel yardımcı proteini hemen 22-24 değerlendirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz yararlı öneriler ve tartışmalar için el yazması ve Dr Rajendra Prasad eleştirel okuma Dr Julie K. Horton teşekkür ederim. Bu araştırmanın bazı bölümleri ilk Biyolojik Kimya, Sassa A et Dergisi yayımlandı. al., "İnsan 8-Oxoguanine DNA glikosilaz en glikosilaz Aktivitesi Üzerine DNA Dizi Bağlam Etkileri." Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı Sağlık Araştırma Projeleri Z01-ES050158 Ulusal Enstitüleri, NIEHS tarafından, tamamen veya kısmen, desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
5’-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG Eurofins MWG Operon 5’-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) Eurofins MWG Operon Polyacrylamide gel purification grade is recommended.
1 ml BD Luer Lock disposable syringe BD Medical 309628 Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
10 ml BD Luer Lock disposable syringe BE Medical 309604 Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well.
Equipment
Circulating water bath Any vender
RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument KinTek Corporation Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well.
Typhoon Phosphorimager 8600 GE Healthcare Life Sciences Imager from other vendors can be used as well.
KaleidaGraph Synergy Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates. Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).
  2. Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).
  3. Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).
  4. Johnson, K. A. Advances in transient-state kinetics. Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).
  5. Johnson, K. A. Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases. Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).
  6. Kovtun, I. V., et al. OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells. Nature. 447, 447-452 (2007).
  7. Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair. Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).
  8. Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).
  9. Waters, T. R., Swann, P. F. Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase. The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).
  10. Nilsen, H., et al. Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase. The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).
  11. Gill, S. C., von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).
  12. Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change. The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).
  13. Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases. Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).
  14. Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG. Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).
  15. Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts. Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).
  16. Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).
  17. Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination. Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).
  18. Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence. Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).
  19. Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY. Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).
  20. Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer. DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).
  21. Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity. DNA Repair. 1, 661-670 (2002).
  22. Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion. DNA Repair. 10, 887-896 (2011).
  23. Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases. Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).
  24. Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease. DNA Repair. 6, 317-328 (2007).

Tags

Kimya Sayı 78 Biyokimya Genetik Moleküler Biyoloji Mikrobiyoloji Yapısal Biyoloji Kimya Biyoloji ökaryot amino asitler peptidler ve Proteinler Nükleik Asitler Nükleotitler ve Nükleositler Enzimler ve koenzimler Yaşam Bilimleri (Genel) enzimoloji hızlı bastırma-akışı aktif bölge titrasyonu kararlı durum öncesi kararlı durum tek cirosu kinetik baz eksizyon onarımı DNA glikozilaz 8-oxo-7 ,8-dihidroguanin 8-oxoG sıralama
DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D.… More

Sassa, A., Beard, W. A., Shock, D. D., Wilson, S. H. Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity. J. Vis. Exp. (78), e50695, doi:10.3791/50695 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter