酪氨酸激酶抑制剂的临床前评价急性白血病的治疗
Summary
受体酪氨酸激酶是异位表达在许多癌症和已被确定为在急性白血病的治疗靶点。此手稿描述为酪氨酸激酶抑制剂对急性白血病的治疗的临床前评价的有效策略。
Abstract
受体酪氨酸激酶有牵连的许多癌症，包括白血病和实体瘤的发生和发展，并且是有吸引力的成药治疗靶点。这里我们描述了一种有效的四步策略的酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）在急性白血病的治疗的临床前评估。最初，western印迹分析是用来确认在培养的白血病细胞中抑制靶。功能活性，然后在使用甲基纤维素或软琼脂培养克隆形成实验评价。这证明在细胞培养实验活动的实验化合物在体内的利用NOD-SCID-γ（NSG）的小鼠与人类白血病细胞株原位移植评估。初步的体内药效学研究评估目标抑制白血病细胞从骨髓中分离。这种方法是用来确定管理所需的有效靶点抑制的剂量和时间安排离子。随后的研究中评估的TKI 在体内使用的荧光素酶表达的白血病细胞的功效，从而允许非侵入性生物发光监测白血病负担和治疗反应的评估使用体内生物发光成像系统。这种策略已经生效的TKI的评价在体外和体内 ，可以应用于识别分子靶向药物的具有治疗潜力或多种化合物的直接比较和确定优先次序。
Introduction
急性淋巴细胞白血病（ALL）是小儿1,2最常见的恶性肿瘤。总体生存率为小儿B系ALL（B-ALL）是约85％，但具体的生物亚型，包括T细胞ALL（T-ALL），仍然有预后较差，即使与目前的治疗方案。复发性ALL的进一步治疗仍然是一个挑战3。尽管大多数成年患者的急性白血病实现与前期化疗缓解，许多患者仍然遭受复发4。在急性白血病的治疗目前的化疗方案是已知的导致毒性相关的短期和长期副作用。因此，非常需要毒性较低的疗法，专门针对癌细胞与正常组织的影响最小。近年来，重点一直放在新颖，具有特异性的分子靶向药物对肿瘤细胞中，经常利用迭代化学的发展以产生必须随后进行比较，并优先5多种活性化合物。这个手稿描述了一种高效的用于治疗急性白血病，可为了便于药物开发用于单个化合物的评价或多个化合物的直接比较策略为TKI的临床前评估。
这里提出的方法包括四个步骤。第一生化（1）和抗白血病（2）的化合物（S）的活性在细胞培养物进行评估，然后抑制靶的被确认的动物模型（3），和TKI（次）的最终治疗效果在白血病原位移植瘤模型确定（4）。对于这些研究，它可以选择有关的细胞系，这是最常见的生物亚型的代表是重要的。细胞系应选择，这两者表达的利益目标和缺乏兴趣的目标，探讨生物效应是否MED通过抑制靶iated。这是特别相关的小分子抑制剂，其具有的脱靶效应，可能是对于抗肿瘤活性是重要的发展。它也有必要选择的细胞系是依赖于目标为功能性的效果，如增殖或存活。利用RNA干扰或其他特定方式抑制靶目标初步验证研究（在本文的范围之内）可以被用来识别目标相关的细胞系。还希望选择能够形成小鼠异种移植物，以使得细胞培养物的结果可以更直接地转化为体内实验的细胞系。
由白血病细胞介导的TKI生化活性的评价，在受体磷酸化的降低，可作为靶抑制的指标。 Western印迹分析或酶联免疫吸附测定法可以采用，这取决于抗体的可用性和特异性。如果是现有抗体具有足够的特异性靶，酶联免疫吸附测定法是优选的，因为它们是更加定量的和有效的。在抗体具有足够的特异性ELISA不可用的情况下，免疫印迹分析可能是必要的。在这种情况下，大量的溶胞产物的免疫沉淀可以用于检测是在低丰度指标是有用的。这种方法是特别相关的磷酸化蛋白质，这可能有一个短的半衰期，以允许快速改变以响应环境刺激信号的测量。一些磷酸化蛋白是非常不稳定的，极有可能为复杂的形成与磷酸酶的结果。鲁棒和一致检测这些磷酸化蛋白，它也可以是可以治疗的细胞与过钒酸盐，一个不可逆的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂6，对磷酸化蛋白质稳定之前制备的全细胞裂解液。
至确定生化活性是否导致了抗肿瘤效果，目标相关的生物学过程可以在基于细胞的试验来监测。对于白血病细胞株，通过TKIs的介导的抗白血病活性可以用甲基纤维素或软琼脂7进行克隆形成实验进行评估。软琼脂中可能是优选的，因为这是一种固体介质是更适合于操作，如果有一个TKI重复治疗是必要的。虽然许多急性myloid白血病（AML）细胞系将形成在软琼脂中集落，大多数ALL细胞系将只形成菌落在甲基纤维素，它是一种半固体培养基中。虽然这是可能的刷新介质和/或在TKI中的甲基纤维素培养物中，只有少量可直接或与有限的频率。同样，它是更难以染色的菌落，而不破坏它们的甲基纤维素。初步的研究应该定义的合适的细胞系以形成菌落在甲基纤维素和/或软琼脂和t的能力他的细胞在培养的最佳密度，使得菌落是不重叠的，并在足够数量以获得统计学上相关的数据（每35毫米板通常50-200集落）。
虽然在体外实验是强大的和具有成本效益，并比整体动物实验中，治疗性化合物的进步较少的伦理问题，需要有效性和安全性在动物模型中证明。对于体内研究，人急性白血病细胞株可原位移植到NOD.Cg-PRKDC SCID我l2rg tm1Wjl / SZJ（NSG）小鼠和TKIs的可以通过注射或口服灌胃很容易管理。某些细胞系，可能需要NSG小鼠暴露于辐射的低细胞系依赖剂量，以便为异种移植物的建立，并且在此实例中没有一个5-10天的恢复期后照射小鼠可能不能耐受口服灌胃。此手稿描述新一代的B-ALL和T-ALL移植使用特定的细胞系（697和Jurkat）作为例子，但异种移植物可使用多种细胞系建立在NSG小鼠。在该事件的其他细胞系是更适用，因为照射的要求，细胞移植，以及疾病发病和进展的定时的最优数量应通过试验确定。理想情况下，这些车型将拥有完全外显率（每次移植动物开发白血病），一致动力学（白血病的进展同样在所有的动物），以及合理的治疗窗口（处理和清除从研究开始的理想20-30天因疾病） 。可以增加细胞移植的数量，以提高外显率和动力学一致性或减少，如果需要改善的治疗窗口。
要确定是否TKIs的调解体内靶抑制，样品与TKI或仅车辆处理后的小鼠白血病移植收集。理想的情况下，剂量的政府对这些实验Ð时间表是由药代动力学研究，而这往往是由商业实验室进行，而且本文的范围之内引导。如果药动学数据是可用的，下面TKI的单剂量所需的有效靶标抑制在细胞培养和最高血清浓度化合物的浓度可以用来定义用于动物研究的起始剂量。药代动力学研究也可以通知样品采集后处理的定时药效学研究和给药途径。靶的抑制可以在任何受影响的器官来评估，但其是最容易收集和处理组织是优选的。大部分急性白血病细胞系建立在肝脏，骨髓，脾，外周血，和中枢神经系统中，虽然具体的受影响器官和植入在这些器官的范围内的模型之间变化。这里介绍的协议评估phosph邻蛋白抑制在使用Western印迹分析的骨髓，但实质器官可能更容易始终如一地收获并需要很少或没有处理之前冷冻，允许磷酸化蛋白质的样品的收集和处理过程中的降解较少机会。免疫组织化学染色，也可用于评估实体瘤或受白血病器官。
最后，TKI（次）的治疗效果在白血病原位移植瘤模型是确定的。在这些研究中，治疗开始的时间可以是多种多样的，这样的疾病或多或少成立。治疗可移植后，立即开始进行初始研究，然后在随后的研究中被延迟，直到显著疾病负担中检测到更接近一个诊断性治疗的模型。理想的是，这些动物模型也有疾病负担的非侵入性测量的能力。我们已经优化了介绍萤火虫路西法的方法酶基因导入使用的病毒样颗粒白血病细胞株，从而为疾病的发病和进展的骨髓和实体器官疾病负担和评估的非侵入性的，纵向分析。临界这种方法是使用单克隆荧光素标记的细胞系，以防止变异性与使用多克隆细胞系的相关荧光素酶表达细胞白血病的发展和无关同一个TKI 8治疗。
合在一起，可用于单个TKI的评价或多个TKI的直接比较和排序这些步骤。虽然这里介绍的协议集中于TKI的发展，这些方法可以适用于其它的目标和考虑检验发展进行了描述。因而，这种策略可能更广泛地适用于分子靶向药物的临床前评价用于治疗急性白血病。
Protocol
Representative Results
Discussion
此手稿描述的有效策略在急性白血病的治疗新型酪氨酸激酶抑制剂评价。使用这种方法，生物化学和抗白血病活性，首先在体外基于细胞的测定在体内异种移植模型中进行评估，然 后。免疫印迹分析已成功用于阐明用的TKI治疗后抑制白血病细胞的目标酪氨酸激酶，并直接在细胞比较多个化合物的效力。在这里介绍的协议，过钒酸盐被用于稳定磷酸化蛋白和靶蛋白浓缩，通过免疫…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
体内成像是利用IVIS共享资源在科罗拉多大学癌症中心（以出让P30-CA046934支持）进行。在流式细胞仪共享资源，科罗拉多大学癌症中心（以出让P30CA046934支持）进行流式细胞术。这项工作是由美国国立卫生研究院（RO1CA137078到DKG）的部分支持。 ABLS是小儿科学家开发计划，由来自美国儿科学会，美国儿科学会和儿童健康与人类发展（K12-HD000850）的尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国立资金支持的资深会员。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
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