Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta
Summary
Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta.
Abstract
Chinasi recettore tirosina sono stati implicati nello sviluppo e nella progressione di molti tumori, compresi sia leucemie e tumori solidi, e sono interessanti bersagli terapeutici druggable. Qui si descrive una strategia in quattro fasi efficiente per la valutazione pre-clinica di inibitori della tirosina chinasi (TKI) nel trattamento della leucemia acuta. Inizialmente, l'analisi western blot è usato per confermare l'inibizione bersaglio in cellule leucemiche in coltura. Attività funzionale viene quindi valutata mediante saggi clonogenici in metilcellulosa o culture soft agar. Composti sperimentali che dimostrano l'attività in cellule saggi di coltura vengono valutate in vivo utilizzando NOD-SCID-gamma (NSG) topi trapiantati ortotopicamente con linee di cellule di leucemia umana. Vivo studi farmacodinamici iniziali nel valutare l'inibizione di destinazione in blasti leucemici isolate dal midollo osseo. Questo approccio viene utilizzato per determinare la dose e lo schema di somministrazione necessaria per un efficace bersaglio inibizioneione. Studi successivi valutare l'efficacia della TKI in vivo utilizzando luciferasi che esprimono cellule leucemiche, consentendo in tal modo non invasivo monitoraggio bioluminescente di carico leucemia e valutazione della risposta terapeutica mediante un sistema di imaging in vivo in bioluminescenza. Questa strategia è stata efficace per la valutazione dei TKI in vitro e in vivo e può essere applicata per l'identificazione di agenti molecolarmente mirati con potenziale terapeutico o per confronto diretto e la prioritizzazione dei composti multipli.
Introduction
Leucemia linfoblastica acuta (ALL) è il tumore maligno più comune nei bambini 1,2. Il tasso di sopravvivenza globale per pediatrica TUTTI I B-lignaggio (B-ALL) è circa il 85%, ma sottotipi biologici specifici, tra cui T-LAL (T-ALL), hanno ancora peggiore prognosi, anche con gli attuali protocolli terapeutici. L'ulteriore trattamento di recidivato ALL rimane una sfida 3. Sebbene la maggior parte dei pazienti adulti con leucemia acuta ottenere una remissione con up-front chemioterapia, molti pazienti soffrono ancora ricaduta 4. Regimi chemioterapici attuali nel trattamento della leucemia acuta sono noti per causare effetti collaterali a breve e lungo termine, tossicità associata. Pertanto, le terapie meno tossiche che colpiscono specificamente le cellule tumorali con effetti minimi sui tessuti normali sono molto necessari. Negli ultimi anni, l'accento è stato posto sullo sviluppo del romanzo, agenti molecolare mirate con specificità per le cellule tumorali, spesso utilizzando la chimica iterativoper generare più composti attivi che devono poi essere comparati e la priorità 5. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica di TKIs per il trattamento della leucemia acuta, che può essere utilizzato per la valutazione di un singolo composto o per confronto diretto dei composti multipli al fine di facilitare lo sviluppo della droga.
Il metodo qui presentato consiste in quattro fasi. Prima della biochimica (1) e anti-leucemia (2) attività del composto (s) vengono valutate in coltura cellulare, allora inibizione del bersaglio viene confermata in modelli animali (3), e l'efficacia terapeutica finalmente del TKI (s) è determinata in modelli di xenotrapianto leucemia ortotopico (4). Per questi studi, è importante scegliere linee cellulari aventi il rappresentanti dei sottotipi biologici più comuni. Le linee cellulari devono essere selezionati, che entrambi, esprimono il target di interesse e manca il bersaglio di interesse, per indagare se gli effetti biologici sono medIATED attraverso l'inibizione del target. Questo è particolarmente importante per lo sviluppo di piccole molecole inibitrici, che hanno effetti off-target che possono essere importanti per l'attività anti-tumorale. È inoltre necessario scegliere una linea cellulare che dipende dal bersaglio per effetti funzionali quali la proliferazione o la sopravvivenza. Studi di validazione obiettivo preliminari (al di fuori del campo di applicazione del presente articolo) utilizzando RNA interference o altri mezzi specifici per inibire l'obiettivo possono essere utilizzati per identificare le linee di cellule bersaglio-dipendente. E 'inoltre opportuno scegliere linee cellulari che possono formare xenotrapianti murini, in modo tale che i risultati delle colture di cellule possono essere più direttamente tradotti in esperimenti in vivo.
Per la valutazione della attività biochimica mediata da TKIs nelle cellule leucemiche, una diminuzione della fosforilazione del recettore può essere utilizzato come indicatore di inibizione bersaglio. Analisi Western blot o ELISA saggi possono essere utilizzati, a seconda della disponibilità e specificità degli anticorpi.Se gli anticorpi con sufficiente specificità per il bersaglio sono disponibili, saggi ELISA sono preferibili in quanto sono più quantitativa ed efficiente. Nei casi in cui gli anticorpi con specificità sufficiente per ELISA non sono disponibili, western blot può essere necessario. In questo caso, immunoprecipitazione di una grande quantità di lisato può essere utile per la rivelazione di bersagli che sono in bassa abbondanza. Questo approccio è particolarmente rilevante per la misura di fosfo-proteine, che possono avere una breve emivita per consentire rapidi cambiamenti nella segnalazione in risposta a stimoli ambientali. Alcune proteine fosforilate sono estremamente labile, molto probabilmente a causa della formazione di complessi con fosfatasi. Per il rilevamento robusto e coerente di queste proteine fosforilate, può anche essere possibile trattare le cellule con pervanadate, un inibitore della proteina-tirosina fosfatasi irreversibile 6, per stabilizzare la proteina-fosfo prima della preparazione di lisati di cellule intere.
Adeterminare se l'attività biochimica provoca effetti anti-tumorali, processi biologici bersaglio-dipendenti possono essere monitorati in esperimenti basati su celle. Per le linee di cellule di leucemia, l'attività anti-leucemia mediata da TKI può essere valutata mediante saggi formazione di colonie effettuati in metilcellulosa o soft agar 7. Soft agar può essere preferito in quanto si tratta di un terreno solido che è più suscettibile di manipolazione, se è necessario il trattamento ripetuto con un TKI. Mentre molti myloid leucemia (AML) linee cellulari acute formeranno colonie in agar morbido, la maggior parte tutte le linee cellulari saranno solo formano colonie in metilcellulosa, che è un mezzo semisolido. Anche se è possibile ricaricare medio e / o TKI in culture metilcellulosa, solo piccoli volumi possono essere usate e con frequenza limitata. Allo stesso modo, è più difficile da macchiare colonie senza interrompere in metilcellulosa. Studi preliminari dovrebbero definire la capacità delle linee cellulari idonee a formare colonie in metilcellulosa e / o agar morbido e tegli densità ottimale delle cellule in coltura in modo che le colonie non si sovrappongono e in numero sufficiente per ottenere statisticamente dati (normalmente 50-200 colonie per piastra da 35 mm Piastra).
Mentre i test in vitro sono robusti e conveniente, e hanno meno implicazioni etiche di esperimenti sugli animali interi, l'avanzamento di composti terapeutici richiede la prova di efficacia e sicurezza nei modelli animali. Per gli studi in vivo, linee cellulari di leucemia acuta umani possono essere ortotopicamente trapiantate in NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SzJ (GFN) topi e TKI possono facilmente essere somministrati per iniezione o sonda gastrica. Alcune linee cellulari possono richiedere l'esposizione di topi dell'NSG ad una dose bassa linea cellulare-dipendente di radiazione al fine di xenotrapianti di stabilire, e in questo caso topi possono non tollerare gavage orale senza un periodo di recupero 5-10 giorni post-irradiazione. Questo manoscritto descrive generazione di B-ALL e T-ALL xenotrapianti usandolinee cellulari specifici (697 e Jurkat) come esempi ma xenotrapianti, possono essere stabilite topi dell'NSG usando un'ampia varietà di linee cellulari. Nel caso in cui altre linee cellulari sono più applicabili, il requisito per irradiazione, numero ottimale di cellule da trapiantare, ei tempi di insorgenza e la progressione della malattia deve essere determinato sperimentalmente. Idealmente, questi modelli avranno penetranza completa (ogni animale trapiantato sviluppa la leucemia), cinetica consistenti (leucemia progredisce in modo simile in tutti gli animali), e una finestra di trattamento ragionevole (idealmente 20-30 giorni tra l'inizio del trattamento e la rimozione dallo studio a causa di malattia) . Il numero di cellule trapiantate può essere aumentata per migliorare penetranza e coerenza cinetica o diminuito per migliorare la finestra trattamento se necessario.
Per determinare se TKI mediano l'inibizione bersaglio in vivo, i campioni vengono prelevati da topi con xenotrapianti leucemia dopo il trattamento con TKI o unico veicolo. Idealmente, la dosed schema di somministrazione per questi esperimenti sono guidati da studi di farmacocinetica, che spesso possono essere eseguite da laboratori commerciali e che sono al di fuori del campo di applicazione del presente articolo. Se non sono disponibili dati di farmacocinetica, la concentrazione del composto richiesta per un'efficace inibizione porta in coltura cellulare e la massima concentrazione sierica dopo una singola dose di TKI può essere utilizzata per definire la dose iniziale per studi sugli animali. Gli studi di farmacocinetica possono anche informare il momento della raccolta del campione di post-trattamento per gli studi di farmacodinamica e la via di somministrazione. L'inibizione del target può essere valutata in qualsiasi organo interessato, ma i tessuti che sono più facilmente raccolti e trattati sono preferibili. Linee cellulari leucemiche più acuti stabilire nel fegato, midollo osseo, milza, sangue periferico e il sistema nervoso centrale, sebbene gli organi specifici interessati e la misura di attecchimento in questi organi varia tra modelli. Il protocollo presentato qui valuta fosfinibizione o-proteine nel midollo osseo mediante analisi Western Blot, ma organi solidi possono essere più facili da raccogliere in modo coerente e richiedono un trattamento minimo o nullo prima del congelamento, consentendo meno opportunità per la degradazione di fosfo-proteine durante la raccolta e l'elaborazione del campione. Immunoistochimica può anche essere utilizzato per valutare tumori solidi o organi affetti da leucemia.
Infine, l'efficacia terapeutica del TKI (s) è determinata in modelli di xenotrapianto ortotopiche leucemia. Per questi studi, i tempi di inizio trattamento può essere variata, in modo che malattia è più o meno stabilita. Il trattamento può iniziare immediatamente dopo il trapianto per gli studi iniziali e poi essere in ritardo negli studi successivi fino a quando viene rilevato un carico di malattia significativa per approssimare più da vicino un modello di trattamento diagnostico. Idealmente, questi modelli animali hanno anche la capacità di misurazione non invasiva del carico di malattia. Abbiamo ottimizzato i metodi per l'introduzione del lucifer lucciolaase gene in linee cellulari di leucemia utilizzando particelle virus-simili, consentendo non invasivo, analisi longitudinale di insorgenza della malattia e la progressione e la valutazione del carico di malattia nel midollo osseo e di organi solidi. Fondamentale per questo approccio è l'uso di linee cellulari luciferasi targhetta monoclonali per prevenire variabilità nello sviluppo di luciferasi che esprimono leucemia associato all'uso di linee cellulari policlonali ed è correlato al trattamento con TKI 8.
Presi insieme, questi passaggi possono essere utilizzati per la valutazione di un singolo TKI o per il confronto diretto e il posizionamento di più TKIs. Mentre i protocolli qui presentati si concentrano sullo sviluppo di TKI, questi metodi possono essere adattati ad altri obiettivi e considerazioni per lo sviluppo di analisi sono descritti. Così, questa strategia può essere più largamente applicabile alla valutazione preclinica di agenti molecolarmente mirati per il trattamento della leucemia acuta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione di nuovi inibitori della tirosina chinasi nel trattamento della leucemia acuta. Usando questo approccio, attività biochimiche e anti-leucemici vengono valutate prima in saggi cellulari in vitro e in modelli di xenotrapianto in vivo. Analisi immunoblot è stato utilizzato con successo per dimostrare l'inibizione della chinasi tirosina bersaglio in cellule leucemiche dopo trattamento con TKI e di confrontare la potenza dei compost…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imaging in vivo è stata eseguita utilizzando il IVIS Shared Resource presso l'Università del Colorado Cancer Center (sostenuto da sovvenzioni P30-CA046934). Citometria a flusso è stato eseguito presso la citometria a flusso di risorse condivise, University of Colorado Cancer Center (sostenuto da sovvenzioni P30CA046934). Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health (RO1CA137078 a DKG). ABLS è membro del Programma di Sviluppo Pediatric Scientist, sostenuta da sovvenzioni dal American Academy of Pediatrics, il Pediatric Society americana e il Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
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