Évaluation pré-clinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë
Summary
Les récepteurs tyrosine kinases sont exprimés de façon ectopique dans de nombreux cancers et ont été identifiés en tant que cibles thérapeutiques dans la leucémie aiguë. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase pour le traitement de la leucémie aiguë.
Abstract
Les récepteurs tyrosine kinases ont été impliquées dans le développement et la progression de nombreux cancers, y compris la leucémie et les tumeurs solides, et sont des cibles thérapeutiques druggable attractifs. Nous décrivons ici une stratégie efficace en quatre étapes pour l'évaluation préclinique des inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) dans le traitement de la leucémie aiguë. Dans un premier temps, l'analyse western blot est utilisé pour confirmer l'inhibition de la cible dans les cellules leucémiques en culture. L'activité fonctionnelle est ensuite évaluée en utilisant des tests clonogéniques dans la méthylcellulose ou cultures agar mou. Composés expérimentaux qui montrent une activité dans des essais de culture de cellules sont évalués in vivo sur des souris NOD-SCID-gamma (NSG) des souris transplantées avec des lignées de cellules leucémiques humaines orthotopique. Vivo études initiales pt pharmacodynamiques évaluer l'inhibition de la cible dans les explosions isolées leucémiques de la moelle osseuse. Cette approche est utilisée pour déterminer la dose et le schéma d'administration requis pour blocage cible efficaceion. Des études ultérieures évaluer l'efficacité de l'EGFR in vivo en utilisant des cellules exprimant la luciférase de la leucémie, permettant ainsi une surveillance non invasive de bioluminescence de la charge de la leucémie et de l'évaluation de la réponse thérapeutique à l'aide d'un système d'imagerie in vivo de la bioluminescence dans. Cette stratégie a été efficace pour l'évaluation des inhibiteurs de tyrosine kinase in vitro et in vivo et peut être appliquée pour l'identification d'agents moléculaires ciblés à fort potentiel thérapeutique ou pour une comparaison directe et la priorisation des composés multiples.
Introduction
Leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est la tumeur maligne la plus fréquente chez les enfants 1,2. Le taux de survie globale pour pédiatrique ALL lignée B (B-ALL) est d'environ 85%, mais les sous-types biologiques spécifiques, y compris T-ALL lignée (T-ALL), ont un pronostic plus pauvre encore, même avec les protocoles thérapeutiques actuels. Un traitement supplémentaire de rechute TOUT reste un défi 3. Bien que la majorité des patients adultes atteints de leucémie aiguë atteindre une rémission avec la chimiothérapie à l'avance, de nombreux patients souffrent encore rechute 4. Chimiothérapies actuelles dans le traitement de la leucémie aiguë sont connus pour causer des effets secondaires à court et à long terme la toxicité associée. Par conséquent, les traitements moins toxiques qui ciblent spécifiquement les cellules cancéreuses avec un effet minimal sur les tissus normaux sont grandement nécessaires. Au cours des dernières années, l'accent a été mis sur le développement de nouveaux agents moléculaires ciblés avec une spécificité pour les cellules cancéreuses, souvent en utilisant la chimie itératifde générer des composés actifs multiples qui doivent ensuite être comparés et priorisés 5. Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation préclinique de TKIs pour le traitement de la leucémie aiguë, qui peut être utilisé pour l'évaluation d'un composé unique ou pour une comparaison directe de composés multiples, afin de faciliter le développement de médicaments.
La méthode présentée ici se compose de quatre étapes. Tout d'abord la substance biochimique (1) et anti-leucémie (2) les activités du composé (s) sont évalués dans une culture cellulaire, puis l'inhibition de la cible est confirmé dans des modèles animaux (3), et l'efficacité finalement thérapeutique du TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique (4). Pour ces études, il est important de choisir des lignées cellulaires compétentes, qui sont des représentants de sous-types biologiques les plus fréquemment utilisés. Les lignées cellulaires doivent être choisis, qui à la fois, exprimer la cible d'intérêt et n'ont pas la cible d'intérêt, afin de déterminer si les effets biologiques sont mediated par inhibition de la cible. Ceci est particulièrement pertinent pour le développement d'inhibiteurs de petites molécules, qui ont des effets hors cible qui peuvent être importantes pour l'activité anti-tumorale. Il est également nécessaire de choisir une lignée cellulaire qui est dépendante de la cible pour les effets fonctionnels tels que la prolifération ou la survie. Études de validation de cibles préliminaires (en dehors de la portée de cet article) en utilisant l'interférence ARN ou d'autres moyens spécifiques pour inhiber la cible peuvent être utilisés pour identifier des lignées de cellules cibles dépendant. Il est également souhaitable de choisir des lignées de cellules qui peuvent former des xénogreffes de souris, de telle sorte que les résultats de la culture de cellules peuvent être plus directement traduits à des expériences in vivo.
Pour l'évaluation de l'activité biochimique médiée par EGFR dans les cellules de la leucémie, une diminution de la phosphorylation du récepteur peut être utilisé comme un indicateur de l'inhibition de la cible. Analyse par Western blot ou ELISA dosages peuvent être employés, en fonction de la disponibilité et de la spécificité des anticorps.Si des anticorps ayant une spécificité suffisante pour que la cible sont disponibles, des tests ELISA sont préférables car ils sont plus efficaces et quantitative. Dans les cas où des anticorps ayant une spécificité suffisante pour le test ELISA ne sont pas disponibles, l'analyse western blot peut être nécessaire. Dans ce cas, l'immunoprécipitation d'une grande quantité de lysat peut être utile pour la détection des cibles qui sont en faible abondance. Cette approche est particulièrement pertinente pour la mesure de phospho-protéines, qui peuvent avoir une demi-vie courte pour permettre des changements rapides dans la signalisation en réponse à des stimuli environnementaux. Certaines protéines phosphorylées sont extrêmement labile, très probablement en raison de la formation de complexes avec des phosphatases. Pour la détection fiable et cohérente de ces protéines phosphorylées, il peut également être possible de traiter les cellules avec pervanadate, un inhibiteur de protéine tyrosine phosphatase irréversible 6, pour stabiliser la protéine phospho-avant pour la préparation de lysats de cellules entières.
Àdéterminer si l'activité biochimique se traduit par des effets anti-tumoraux, des processus biologiques dépendant de cibles peuvent être contrôlés dans les expériences à base de cellules. Pour les lignées cellulaires de leucémie, activité anti-leucémie induite par TKI peut être évaluée en utilisant des dosages de formation de colonies en méthylcellulose effectuées sur gélose molle ou 7. L'agar mou peut être préféré car il s'agit d'un milieu solide qui se prête mieux à une manipulation répétée si le traitement avec un TKI est nécessaire. Alors que de nombreux leucémie myloid (AML) lignées cellulaires aigus seront former des colonies en agar mou, la plupart des toutes les lignées cellulaires seront seulement forment des colonies dans de la méthylcellulose, qui est un milieu semi-solide. Bien qu'il soit possible de rafraîchir moyen et / ou EGFR dans des cultures de méthylcellulose, seuls de petits volumes peuvent être utilisés et avec une fréquence limitée. De même, il est plus difficile pour colorer les colonies sans les perturber dans la méthylcellulose. Des études préliminaires doivent définir la capacité des lignées cellulaires appropriées pour former des colonies dans de la méthylcellulose et / ou de l'agar mou et til densité optimale des cellules en culture de telle sorte que les colonies ne se chevauchent pas et en nombre suffisant pour obtenir des données statistiquement pertinentes (généralement 50-200 colonies par 35 mm plaque).
Bien que des essais in vitro sont robustes et rentables, et ont des implications éthiques de moins que les expérimentations animales entières, l'avancement de composés thérapeutiques nécessite une preuve de l'efficacité et de la sécurité dans des modèles animaux. Pour les études in vivo, les lignées cellulaires de la leucémie aiguë humains peuvent être transplantées dans orthotopiquement NOD.Cg-PRKDC scid je l2rg tm1Wjl / SZJ des souris (NSG) et ITK peuvent être facilement administrés par injection ou par gavage oral. Certaines lignées cellulaires peuvent nécessiter l'exposition de souris NSG à une faible dose de ligne cellulaire dépendante de rayonnement afin de xénogreffes d'établir, et dans ce cas les souris ne peuvent pas tolérer gavage oral sans une période de récupération de 5-10 jours post-irradiation. Ce manuscrit décrit la génération de B-ALL et T-ALL xénogreffes aidedes lignées cellulaires spécifiques (697) et Jurkat comme exemples, mais peut être créé, des xénogreffes chez des souris NSG utilisant une grande variété de lignées cellulaires. Dans le cas où d'autres lignées cellulaires sont plus applicables, l'obligation pour l'irradiation, le nombre optimal de cellules de greffe, et le moment d'apparition et de progression de la maladie doit être déterminée expérimentalement. Idéalement, ces modèles auront pénétrance complète (tous les animaux transplantés développe une leucémie), la cinétique cohérentes (leucémie progresse de manière similaire chez tous les animaux), et une fenêtre de traitement raisonnable (idéalement 20 à 30 jours entre le début du traitement et le retrait de l'étude en raison d'une maladie) . Le nombre de cellules transplantées peut être augmentée afin d'améliorer la cohérence et la pénétrance cinétique ou réduite afin d'améliorer la fenêtre de traitement si nécessaire.
Pour déterminer si l'inhibition de EGFR médiation cible in vivo, les échantillons sont collectés à partir de souris atteintes de leucémie xénogreffes après traitement par TKI ou le véhicule seul. Idéalement, la dose d'und schéma d'administration pour ces expériences sont guidés par des études pharmacocinétiques, qui peuvent souvent être réalisées par des laboratoires commerciaux et sont en dehors du champ d'application de cet article. Si les données pharmacocinétiques sont disponibles, la concentration du composé nécessaire pour une inhibition efficace de la cible dans une culture de cellules et la concentration sérique maximale après une dose unique de TKI peut être utilisé pour définir une dose de départ pour des études sur les animaux. Les études pharmacocinétiques peuvent également informer le calendrier de la collecte de l'échantillon de post-traitement pour les études pharmacodynamiques et la voie d'administration. L'inhibition de la cible peut être évaluée dans n'importe quel organe affecté, mais les tissus qui sont le plus facilement collectées et traitées sont préférables. Des lignées cellulaires de leucémie plus aigus établir dans le foie, la moelle osseuse, de la rate, du sang périphérique et du système nerveux central, bien que les organes spécifiques touchés et la mesure de la prise de greffe dans ces organes varient selon les modèles. Le protocole présenté ici évalue phosphinhibition o-protéine dans la moelle osseuse en utilisant une analyse Western blot, mais les organes solides peuvent être plus faciles à récolter constamment et nécessitent peu ou pas de traitement avant la congélation, ce qui permet moins de possibilités pour la dégradation de phospho-protéines pendant la collecte et le traitement des échantillons. L'immunohistochimie peut être utilisée pour évaluer des tumeurs ou des organes affectés par la leucémie solides.
Enfin, l'efficacité thérapeutique de la TKI (s) est déterminée dans des modèles de xénogreffe de leucémie orthotopique. Pour ces études, le moment de l'initiation du traitement peut varier, de sorte que la maladie est plus ou moins établi. Le traitement peut commencer immédiatement après la transplantation pour les études initiales et ensuite être retardé dans des études ultérieures jusqu'à ce que la charge de morbidité importante est détectée de rapprocher plus étroitement un modèle de traitement de diagnostic. Idéalement, ces modèles animaux ont également la capacité pour la mesure non invasive de la charge de la maladie. Nous avons optimisé les méthodes pour l'introduction de la lucifer luciolease gène dans des lignées cellulaires de leucémie à l'aide de particules de type virus, ce qui permet, à l'analyse non-invasive longitudinal de l'apparition et de la progression et de l'évaluation de la charge de la maladie de la moelle osseuse et les organes solides maladie. Cruciale de cette approche est l'utilisation de lignées de cellules de luciférase monoclonaux marqués pour éviter la variabilité dans le développement de la leucémie exprimant la luciférase lié à l'utilisation de lignées cellulaires polyclonales et est sans rapport avec le traitement par un ITK 8.
Prises ensemble, ces mesures peuvent être utilisées pour l'évaluation d'un seul TKI ou pour une comparaison directe et le classement de plusieurs ITK. Bien que les protocoles présentés ici se concentrent sur le développement de ITK, ces méthodes peuvent être adaptées à d'autres objectifs et considérations pour le développement de tests sont décrits. Ainsi, cette stratégie peut être plus largement applicable à l'évaluation pré-clinique d'agents moléculaires ciblées pour le traitement de la leucémie aiguë.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit une stratégie efficace pour l'évaluation de nouveaux inhibiteurs de tyrosine kinase dans le traitement de la leucémie aiguë. En utilisant cette approche, les activités biochimiques et anti-leucémie sont évaluées en premier dans les tests cellulaires in vitro et dans des modèles de xénogreffe in vivo. analyse par immunotransfert a été utilisée avec succès pour démontrer l'inhibition de la tyrosine kinase cible dans des cellules de leucémie après traitement a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'imagerie in vivo a été réalisée à l'aide du SIIV de ressources partagées à l'Université du Colorado Cancer Center (soutenu par subvention P30-CA046934). Cytométrie en flux a été réalisée à la cytométrie en flux de ressources partagées, de l'Université du Colorado Cancer Center (soutenu par subvention P30CA046934). Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de sanitaires (RO1CA137078 à DKG). Antipatinage est membre du programme de développement scientifique de pédiatrie, soutenue par des subventions de l'American Academy of Pediatrics, l'American Pediatric Society, et l'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health et le développement humain (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
