Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie
Summary
Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.
Abstract
Receptor tyrosine kinases zijn betrokken bij de ontwikkeling en progressie van vele kankers, waaronder zowel leukemie en vaste tumoren en aantrekkelijk druggable therapeutische doelwitten. Hier beschrijven we een efficiënte vier stappen strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren (TKI) voor de behandeling van acute leukemie. Aanvankelijk wordt western blot analyse gebruikt remming doelwit gekweekte leukemiecellen bevestigen. Functionele activiteit geëvalueerd middels klonogene assays methylcellulose of zachte agar culturen. Experimentele verbindingen die activiteit in celcultuur assays tonen worden geëvalueerd in vivo gebruik van NOD-SCID-gamma (NSG) muizen orthotopically getransplanteerd met menselijke leukemie cellijnen. Initiële in vivo farmacodynamische studies evalueren doel remming in leukemische ontploffing geïsoleerd uit het beenmerg. Deze benadering wordt gebruikt om de dosis en het toedieningsschema nodig zijn voor een effectieve doelwit remmen bepalenion. Latere studies evalueren van de werkzaamheid van de TKI's in vivo middels luciferase expressie leukemiecellen, waardoor voor niet-invasieve monitoring van bioluminescente leukemie last en evaluatie van de therapeutische respons toepassing van een in vivo bioluminescentie beeldvormingssysteem. Deze strategie is effectief voor de evaluatie van TKI's in vitro pt in vivo en kan worden toegepast voor de identificatie van moleculair gerichte middelen met therapeutisch potentieel of voor directe vergelijking en prioritering van meerdere verbindingen.
Introduction
Acute lymfatische leukemie (ALL) is de meest voorkomende maligniteit bij kinderen 1,2. De totale overleving voor kinderen B-lijn ALL (B-ALL) is ongeveer 85%, maar specifieke biologische subtypen, waaronder T-lineage ALL (T-ALL), hebben nog steeds slechtere prognose, zelfs met de huidige therapeutische protocollen. Verdere behandeling van recidief ALL blijft een uitdaging 3. Hoewel de meerderheid van volwassen patiënten met acute leukemie bereiken van een remissie met up-front chemotherapie, veel patiënten nog steeds last terugval 4. Huidige chemotherapeutische regimes bij de behandeling van acute leukemie is bekend dat-toxiciteit verbonden korte en lange termijn bijwerkingen veroorzaken. Derhalve minder toxische therapieën die specifiek kankercellen met minimale effecten op normale weefsels zeer nodig. De laatste jaren is de nadruk gelegd op de ontwikkeling van nieuwe, moleculair-gerichte middelen met specificiteit voor kankercellen vaak gebruik iteratieve chemie geplaatstmeerdere actieve verbindingen die vervolgens worden vergeleken met prioriteit 5 genereren. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van TKI voor de behandeling van acute leukemie, die kan worden gebruikt voor de evaluatie van een verbinding of een rechtstreekse vergelijking van verschillende verbindingen om de ontwikkeling van geneesmiddelen vergemakkelijken.
De hier gepresenteerde methode bestaat uit vier stappen. Eerst de biochemische (1) en anti-leukemie (2) van de vrije verbinding (en) worden geëvalueerd in celkweek dan remming van de doelstelling wordt bevestigd in diermodellen (3), en tenslotte therapeutische werking van de TKI (s) wordt bepaald leukemie orthotope xenograft modellen (4). Voor deze studies is het belangrijk om relevante cellijnen die vertegenwoordigers van de meest voorkomende biologische subtypes zijn kiezen. Cellijnen moeten worden geselecteerd, die beide, drukken het doelwit van belang en niet de doelgroep van belang zijn, te onderzoeken of biologische effecten worden mediated door remming van het doel. Dit is bijzonder relevant voor de ontwikkeling van kleine molecule inhibitoren die off-doeleffecten die voor antitumoractiviteit bedraagt. Het is ook noodzakelijk om een cellijn die afhankelijk is van het doel van functionele effecten zoals proliferatie of overleving kiezen. Voorlopige doelbevestiging studies (buiten het bestek van dit artikel) met RNA interferentie of andere specifieke wijze aan het doel inhiberen kunnen worden gebruikt om doel-afhankelijke cellijnen te identificeren. Het is ook wenselijk om cellijnen die murine xenotransplantaten, zodat resultaten celkweek directer vertaald in vivo experimenten kan worden kan vormen kiezen.
Voor de evaluatie van de biochemische activiteit gemedieerd door TKI in leukemiecellen, kan een afname in receptor fosforylatie worden gebruikt als een indicator van target inhibitie. Western blot analyse of ELISA assays kunnen worden toegepast, afhankelijk van de beschikbaarheid en de specificiteit van antilichamen.Als antilichamen met voldoende specificiteit voor het doelwit zijn, ELISA assays de voorkeur omdat ze meer kwantitatief en efficiënt. Wanneer antilichamen met voldoende specificiteit voor ELISA beschikbaar zijn, kunnen Western-blot-analyse nodig zijn. In dit geval kan immunoprecipitatie van grote hoeveelheden lysaat nuttig voor de detectie van doelen die in geringe hoeveelheden worden. Dit is bijzonder relevant voor het meten van fosfo-eiwitten, die een korte halfwaardetijd te zorgen voor snelle veranderingen in signalering in respons op omgevingsstimuli. Sommige gefosforyleerde eiwitten zijn zeer labiel, waarschijnlijk als gevolg van complexvorming met fosfatasen. Voor robuuste en consistente detectie van deze gefosforyleerde proteïnen, kan het ook mogelijk om cellen te behandelen met pervanadaat, een irreversibele proteïne-tyrosine fosfatase inhibitor 6, de fosfo-eiwit gestabiliseerd preparaat van gehele cellysaten.
Aanbepalen of biochemische activiteit resulteert in anti-tumor effecten kan doel-afhankelijke biologische processen worden gecontroleerd op cellen gebaseerde experimenten. Voor leukemie cellijnen, kunnen anti-leukemie-activiteit gemedieerd door TKI beoordeeld met behulp kolonievorming assays uitgevoerd in methylcellulose of zachte agar 7. Zachte agar kunnen de voorkeur omdat dit een vast medium dat is meer vatbaar voor manipulatie of herhaalde behandeling met een TKI noodzakelijk. Hoewel veel myloid acute leukemie (AML) cellijnen kolonies in zachte agar zal vormen, de meeste alle cellijnen alleen kolonies te vormen methylcellulose, een half-vast medium. Hoewel het mogelijk is om medium en / of TKI bij te methylcellulose culturen slechts kleine hoeveelheden gebruikt en met beperkte frequentie. Ook is het moeilijker om kolonies te kleuren zonder verstoring hen methylcellulose. Voorlopige studies moet de mogelijkheid van geschikte cellijnen kolonies gevormd in methylcellulose en / of zachte agar en t definiërenhij optimale dichtheid van cellen in cultuur zodanig dat kolonies niet-overlappende en in voldoende aantal om statistisch relevante gegevens te verkrijgen (meestal 50-200 kolonies per 35 mm plaat).
Terwijl in vitro assays robuust en kosteneffectief, en hebben minder ethische implicaties dan geheel dierproeven, vooruitgang van therapeutische verbindingen vereist bewijs van werkzaamheid en veiligheid in diermodellen. Voor in vivo studies, kunnen menselijke acute leukemie cellijnen orthotopically worden getransplanteerd in NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) muizen en TKI's kunnen gemakkelijk worden toegediend door injectie of orale sondevoeding. Sommige cellijnen kunnen blootstelling van NSG muizen een laag cellijn-afhankelijke dosis straling nodig hebben om voor xenografts vast te stellen, en in dit geval muizen orale sondevoeding niet kan verdragen zonder een 5-10 dag herstelperiode na de bestraling. Dit manuscript beschrijft de generatie van B-ALL en T-ALL xenograften gebruikspecifieke cellijnen (697 en Jurkat) als voorbeelden maar xenotransplantaten worden vastgesteld NSG muizen met een groot aantal cellijnen. Indien andere cellijnen zijn van toepassing de vereiste bestraling optimale aantal cellen transplantatie, en de timing van ziektebegin en progressie worden experimenteel bepaald. Idealiter zal deze modellen volledige penetrantie (elk dier getransplanteerd ontwikkelt leukemie), consistente kinetiek (leukemie verloopt op dezelfde wijze in alle dieren), en een redelijke behandeling raam (idealiter 20-30 dagen tussen de start van de behandeling en verwijdering van studie als gevolg van ziekte) . Het aantal cellen getransplanteerd kan worden verhoogd tot penetrantie en kinetische consistentie verbeteren of verlaagd om eventueel de behandelingsvenster verbeteren.
Om te bepalen of TKIs bemiddelen remming doel in vivo, worden monsters verzameld van muizen met leukemie xenograften na behandeling met TKI of enige voertuig. In het ideale geval de dosis eend toedieningsschema voor deze experimenten worden geleid door farmacokinetische studies, die vaak worden uitgevoerd door commerciële laboratoria en vallen buiten het bestek van dit artikel. Als farmacokinetische gegevens beschikbaar, kan de concentratie van de verbinding vereist voor effectieve remming doel in celkweek en de maximale serumconcentratie na een enkele dosis TKI worden gebruikt om een startdosis voor dierproeven definiëren. Farmacokinetische studies kunnen ook de timing van de monstername na de behandeling te informeren voor farmacodynamische studies en de wijze van toediening. Remming van het doel kan worden beoordeeld in welke aangetaste orgaan, maar weefsels die het gemakkelijkst worden verzameld en verwerkt zijn voorkeur. De meeste acute leukemie cellijnen te vestigen in de lever, beenmerg, milt, perifeer bloed en het centrale zenuwstelsel, hoewel het specifieke organen aangetast en de mate van implantatie in deze organen varieert modellen. De hier gepresenteerde protocol beoordeelt phosphinhibitie o-eiwit in het beenmerg met Western blot-analyse, maar solide organen kan makkelijker zijn om consequent te oogsten en vereisen weinig of geen bewerking vóór het invriezen, waardoor minder kans op degradatie van fosfo-eiwitten tijdens monstername en verwerking. Immunohistochemie kan worden gebruikt om vaste tumoren of organen aangetast door leukemie evalueren.
Tenslotte wordt de therapeutische werking van de TKI (s) bepaald leukemie orthotope xenograft modellen. Voor deze studies, kan de timing van de start van de behandeling worden gevarieerd, zodat de ziekte min of meer vaststaat. De behandeling kan na transplantatie onmiddellijk beginnen voor de eerste studies en dan worden uitgesteld in volgende studies tot een significante ziektelast wordt gedetecteerd nauwer benaderen een diagnostische behandeling model. Idealiter zijn diermodellen hebben ook het vermogen om niet-invasieve meting van ziektelast. We hebben methoden voor de invoering van de vuurvlieg lucifer geoptimaliseerdease gen in leukemie cellijnen met behulp van virus-achtige deeltjes, waardoor voor niet-invasieve, longitudinale analyse van de ziekte ontstaan en de progressie en de beoordeling van de ziektelast in het beenmerg en vaste organen. Essentieel voor deze benadering is het gebruik van monoklonale-luciferase gelabeld cellijnen variabiliteit van ontwikkeling van luciferase expressie leukemie geassocieerd met het gebruik van polyklonale cellijnen voorkomen en is niet gerelateerd aan de behandeling met een TKI 8.
Tezamen kunnen deze stappen worden gebruikt voor de evaluatie van een TKI of voor directe vergelijking en ranking van meerdere TKIs. Hoewel de hier gepresenteerde protocollen gericht op de ontwikkeling van TKI, kunnen deze werkwijzen worden aangepast aan andere doelen en overwegingen voor analyseontwikkeling beschreven. Aldus kan deze strategie breder voor de pre-klinische evaluatie van moleculair-gerichte middelen voor behandeling van acute leukemie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript beschrijft een effectieve strategie voor de evaluatie van nieuwe tyrosine kinase inhibitoren bij de behandeling van acute leukemie. Met deze benadering worden biochemische en anti-leukemie activiteiten eerst geëvalueerd in celgebaseerde proeven in vitro en in vivo xenograft modellen. Immunoblotanalyse is succesvol toegepast om remming van het doel tyrosine kinase in leukemiecellen na behandeling met TKI tonen en direct vergelijken van de potentie van meerdere verbindingen in ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In vivo beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de IVIS Shared Resource aan de Universiteit van Colorado Cancer Center (ondersteund door subsidie P30-CA046934). Flowcytometrie werd uitgevoerd bij de flowcytometrie Shared Resource, Universiteit van Colorado Cancer Center (ondersteund door subsidie P30CA046934). Dit werk werd mede ondersteund door de National Institutes of Health (RO1CA137078 naar DKG). ABLS is een Fellow van de Pediatric Scientist Development Program, ondersteund door subsidies van de Amerikaanse Academie voor Kindergeneeskunde, de American Pediatric Society, en het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
