Præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere for Behandling af akut leukæmi
Summary
Receptortyrosinkinaser er ektopisk udtrykkes i mange cancertyper og er blevet identificeret som terapeutiske mål i akut leukæmi. Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til præ-klinisk vurdering af tyrosinkinaseinhibitorer til behandling af akut leukæmi.
Abstract
Receptortyrosinkinaser har været impliceret i udviklingen og progressionen af mange kræftformer, herunder både leukæmi og solide tumorer, og er attraktive druggable terapeutiske mål. Her beskriver vi en effektiv fire trin strategi for præklinisk evaluering af tyrosinkinasehæmmere (Tkis) i behandlingen af akut leukæmi. Indledningsvis er Western blot-analyse anvendt til at bekræfte target hæmning i dyrkede leukæmiceller. Funktionel aktivitet evalueres derefter bruge klonogene assays i methylcellulose eller blød agar kulturer. Eksperimentelle forbindelser, der demonstrerer aktivitet i cellekultur-assays er vurderet in vivo ved hjælp af NOD-SCID-gamma (NSG)-mus transplanteret orthotopisk med humane leukæmi-cellelinier. Indledende in vivo farmakodynamiske undersøgelser evaluere mål hæmning i leukæmiske blaster isoleret fra knoglemarven. Denne fremgangsmåde anvendes til at bestemme dosis og administration er nødvendig for effektiv mål hæmmerion. Efterfølgende undersøgelser evaluere effekten af TKI'er in vivo under anvendelse luciferase udtrykker leukæmiceller, hvilket giver mulighed for ikke-invasiv bioluminescerende overvågning af leukæmi byrde og vurdering af det terapeutiske respons ved hjælp af en in vivo bioluminescens imaging system. Denne strategi har været effektiv til evaluering af TKIs in vitro og in vivo, og kan anvendes til identifikation af molekylært målrettede agenter med terapeutisk potentiale eller til direkte sammenligning og prioritering af flere forbindelser.
Introduction
Akut lymfoblastisk leukæmi (ALL) er den mest almindelige malignitet hos børn 1,2. Den samlede overlevelse for pædiatrisk B-afstamning ALL (B-ALL) er ca 85%, men specifikke biologiske undertyper, herunder T-slægt ALL (T-ALL), har stadig dårligere prognose, selv med nuværende terapeutiske protokoller. Yderligere behandling af recidiverende ALL fortsat en udfordring 3. Selv om de fleste voksne patienter med akut leukæmi opnå en remission med up-front kemoterapi, mange patienter stadig lider tilbagefald 4. Aktuelle kemoterapeutiske regimer i behandlingen af akut leukæmi, er kendt for at forårsage toksicitet-associeret kort-og langsigtede bivirkninger. Derfor er mindre giftige behandlinger, der specifikt retter sig mod kræftceller med minimal effekt på normale væv stort behov. I de senere år er der lagt vægt på udvikling af nye, molekylært målrettede agenter med specificitet for kræftceller, ofte udnytter iterative kemiat generere flere aktive forbindelser, som derefter skal sammenlignes og prioriteret 5.. Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til præ-klinisk vurdering af TKI'er til behandling af akut leukæmi, som kan anvendes til evaluering af en enkelt forbindelse eller en direkte sammenligning af flere forbindelser for at lette udvikling af lægemidler.
Metoden præsenteres her består af fire trin. Først biokemiske (1) og anti-leukæmi (2) aktiviteter af forbindelsen (e) er evalueret i cellekultur, og derefter inhibering af målet er bekræftet i dyremodeller (3), og endelig terapeutiske effekt TKI (r) bestemmes i ortotopisk leukæmi xenograftmodeller (4). Til disse undersøgelser, er det vigtigt at vælge relevante cellelinjer, som er repræsentanter for de mest almindelige biologiske undertyper. Bør vælges cellelinjer, som begge giver udtryk for målet af interesse og mangler mål af interesse at undersøge, om biologiske effekter withiated ved inhibering af målet. Dette er særlig relevant for udvikling af små molekyle inhibitorer, som har ikke-tilsigtede virkninger, der kan være vigtige for anti-tumor aktivitet. Det er også nødvendigt at vælge en cellelinie, som er afhængig af målet for funktionelle virkninger såsom proliferation eller overlevelse. Foreløbige mål valideringsstudier (uden for rammerne af denne artikel) ved hjælp af RNA-interferens eller andre specifikke midler til at hæmme målet kan bruges til at identificere target-afhængige cellelinier. Det er også ønskeligt at vælge cellelinier, der kan danne murine xenotransplantater, således at cellekultur resultater kan være mere direkte oversat til in vivo eksperimenter.
Ved evaluering af biokemisk aktivitet medieret af TKI'er i leukæmiceller, kan et fald i receptor-phosphorylering anvendes som en indikator for målet hæmning. Western-blot-analyse eller ELISA-assays kan anvendes, afhængigt af tilgængeligheden og specificiteten af antistoffer.Hvis antistoffer med tilstrækkelig specificitet for målet er til rådighed, ELISA-assays er at foretrække, da de er mere kvantitativ og effektiv. I tilfælde, hvor antistoffer med tilstrækkelig specificitet til ELISA er tilgængelige, kan det være nødvendigt western blot analyse. I dette tilfælde kan immunopræcipitation af en stor mængde af lysat være nyttig til påvisning af mål, der er i lav tæthed. Denne fremgangsmåde er særlig relevant til måling af fosfor proteiner, som kan have en kort halveringstid for at muliggøre hurtige ændringer i signalering som reaktion på miljømæssige stimuli. Nogle phosphorylerede proteiner er ekstremt labile, sandsynligvis som følge af kompleksdannelse med phosphataser. For robust og konsekvent detektering af disse phosphorylerede proteiner, kan det også være muligt at behandle celler med pervanadat, en irreversibel proteintyrosinkinase phosphataseinhibitor 6 at stabilisere phospho-protein forud for fremstilling af helcellelysater.
Tilafgøre, om biokemisk aktivitet resulterer i anti-tumor-virkninger, kan mål-afhængige biologiske processer overvåges i cellebaserede forsøg. For leukæmi cellelinier, kan anti-leukæmi aktivitet medieret af TKIs vurderes ved hjælp kolonidannelse analyser udført i methylcellulose eller blød agar 7. Blød agar kan foretrækkes, da dette er et fast medium, der er mere modtagelig for manipulation, hvis det er nødvendigt gentagen behandling med en TKI. Mens mange akutte myloid leukæmi (AML)-cellelinjer vil danne kolonier i blød agar, vil de fleste ALLE cellelinjer kun danne kolonier i methylcellulose, der er en halvfast medium. Selv om det er muligt at opdatere medium og / eller TKI'er i methylcellulose kulturer, kan kun små mængder skal anvendes, og med begrænset frekvens. Ligeledes er det vanskeligere at plette kolonier uden at forstyrre dem i methylcellulose. Foreløbige undersøgelser bør definere evne egnede cellelinier til at danne kolonier i methylcellulose og / eller blød agar og than optimal tæthed af celler i kultur sådan, at kolonier er ikke-overlappende og i tilstrækkeligt antal til at opnå statistisk relevante data (normalt 50-200 kolonier pr 35 mm plade).
Mens in vitro assays er robuste og omkostningseffektive, og har færre etiske implikationer end hele dyreforsøg, fremme af terapeutiske forbindelser kræver bevis for effekt og sikkerhed i dyremodeller. For in vivo-undersøgelser, kan humane akut leukæmi cellelinier orthotopisk transplanteret ind NOD.Cg-Prkdc SCID jeg l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) mus og TKIs kan let administreres ved injektion eller oral sonde. Nogle cellelinier kan kræve eksponering af NSG mus til et lavt cellelinie-afhængige strålingsdosis for at xenotransplantater at etablere, og i dette tilfælde kan musene ikke tåle oral sondeernæring uden en 5-10 dages restitutionsperiode efter bestråling. Dette håndskrift beskriver generation af B-ALL og T-ALL xenografter hjælpspecifikke cellelinier (697 og Jurkat) som eksempler, men implanteret kan være etableret i NSG mus ved hjælp af en bred vifte af cellelinier. I tilfælde af at andre cellelinier er mere anvendelig og kravet om bestråling optimale antal celler til transplantation, og tidspunktet for sygdommens indtræden og progression skal bestemmes eksperimentelt. Ideelt set vil disse modeller har fuldstændig penetrans (hvert dyr transplanteret udvikler leukæmi), konsekvente kinetik (leukæmi skrider på samme måde i alle dyr) og en rimelig behandling vindue (ideelt 20-30 dage mellem initiering af behandling og fjernelse fra undersøgelsen på grund af sygdom) . Antallet af celler transplanteret kan øges for at forbedre penetrans og kinetisk konsistens eller reduceres for at forbedre behandlingen vinduet, hvis det er nødvendigt.
At afgøre, om TKIs mægle mål hæmning in vivo, der prøver fra mus med leukæmi implanteret efter behandling med TKI eller eneste køretøj. Ideelt dosis end tidsplan for administration for disse eksperimenter er styret af farmakokinetiske studier, som ofte kan udføres af kommercielle laboratorier og er uden for rammerne af denne artikel. Hvis der foreligger farmakokinetiske data, kan koncentrationen af forbindelse, der kræves for en effektiv mål hæmning i cellekultur og den maksimale serumkoncentration efter en enkelt dosis af TKI bruges til at definere en dosis for dyreforsøg start. Farmakokinetiske undersøgelser kan også informere timingen af prøvetagningen efterbehandling for farmakodynamiske undersøgelser og administrationsvejen. Hæmning af målet kan vurderes i alle berørte organ, men væv, der er lettest indsamles og behandles, er at foretrække. Mest akutte leukæmi cellelinier etablere sig i leveren, knoglemarv, milt, perifert blod, og det centrale nervesystem, selv om de specifikke berørte organer og omfanget af transplantation i disse organer varierer mellem modeller. Protokollen præsenteres her vurderer Phospho-protein-hæmning i knoglemarven ved hjælp western blot analyse, men faste organer kan være lettere at konsekvent høste og kræver minimal eller ingen behandling inden frysning, så mindre mulighed for nedbrydning af fosfor proteiner under prøven indsamling og behandling. Immunohistokemi kan også bruges til at evaluere solide tumorer eller organer ramt af leukæmi.
Endelig er den terapeutiske effektivitet af TKI (r) bestemt i ortotopisk leukæmi xenograftmodeller. Til disse studier kan timingen af behandlingsstart varieres, således at sygdom er mere eller mindre etableret. Behandlingen kan påbegyndes umiddelbart efter transplantation for indledende undersøgelser og derefter blive forsinket i efterfølgende undersøgelser indtil betydelig sygdomsbyrde opdages til i højere grad tilnærme en diagnostisk behandling model. Ideelt set er disse dyremodeller har også evnen til ikke-invasiv måling af sygdomstilfælde. Vi har optimeret metoder til indførelse af ildflue luciferase-genet i leukæmicellelinjer anvendelse af virus-lignende partikler, der giver mulighed for ikke-invasiv, longitudinal analyse af sygdommens indtræden og progression og vurdering af sygdomsbyrden i knoglemarv og massive organer. Afgørende for denne fremgangsmåde er anvendelse af monoklonale luciferase-mærket cellelinjer forhindre variation i udviklingen af luciferase-udtrykkende leukæmi er forbundet med anvendelsen af polyklonale cellelinier og er relateret til behandling med en TKI 8.
Tilsammen kan disse trin anvendes til evaluering af et enkelt TKI eller til direkte sammenligning og rangordning af flere TKIs. Mens de protokoller, der præsenteres her at fokusere på udvikling af TKI'er kan disse metoder kan tilpasses til andre mål og overvejelser for assayudvikling beskrevet. Derfor kan denne strategi være mere bredt anvendelig til præklinisk evaluering af molekylært målrettede midler til behandling af akut leukæmi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette håndskrift beskriver en effektiv strategi til evaluering af nye tyrosinkinaseinhibitorer i behandlingen af akut leukæmi. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, er biokemiske og anti-leukæmi-aktiviteter evalueres først i cellebaserede assays in vitro og derefter i xenograftmodeller in vivo. Immunoblotanalyse blev anvendt med succes til at påvise inhibering af målet tyrosinkinase i leukæmiceller efter behandling med TKI'er og direkte at sammenligne styrken af flere forbindelser …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In vivo imaging blev udført ved hjælp af IVIS Shared Resource på University of Colorado Cancer Center (støttet af tilskud P30-CA046934). Flowcytometri blev udført på Flowcytometri Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (støttet af tilskud P30CA046934). Dette arbejde blev støttet delvist af National Institutes of Health (RO1CA137078 til DKG). ABLS er en Fellow af Pediatric Scientist Development Program, støttet af tilskud fra American Academy of Pediatrics, American Pediatric Society, og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
