הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה
Summary
טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה.
Abstract
טירוזין קינאז רצפטור היה מעורב בפיתוח וההתקדמות של סרטן רבים, כולל שני לוקמיה וגידולים מוצקים, והם מטרות טיפוליות druggable אטרקטיביים. כאן אנו מתארים אסטרטגית ארבעת שלבים יעילים להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול בלוקמיה חריפה. בתחילה, ניתוח כתם מערבי משמש כדי לאשר את עיכוב היעד בתאים לוקמיה בתרבית. פעילות פונקציונלית אז הוא הוערך באמצעות מבחני clonogenic בmethylcellulose או תרבויות אגר רכות. תרכובות ניסיוניות המדגימות פעילות במבחני תרבית תאים מוערכות in vivo באמצעות עכברי NOD-SCID-גמא (NSG) המושתלים orthotopically עם שורות תאים לוקמיה. במחקרי vivo pharmacodynamic ראשוניים להעריך עיכוב יעד בתקיעות leukemic מבודדת ממח העצם. גישה זו משמשת כדי לקבוע את המינון ואת לוח זמנים של ממשל נדרש ללעכב יעד אפקטיבייון. מחקרים מאוחרים יותר להעריך את היעילות של TKIs in vivo באמצעות לוציפראז לבטא בתאי סרטן דם, ובכך לאפשר לניטור bioluminescent לא פולשנית של נטל לוקמיה והערכת התגובה לטיפול באמצעות vivo מערכת הדמיה פליטת אור ב. אסטרטגיה זו הייתה יעילה להערכה של TKIs במבחנה in vivo ויכולה להיות מיושמת לצורך זיהוי של סוכנים ממוקדים מולקולריים עם פוטנציאל טיפולי או להשוואה ולתעדוף ישירים של תרכובות מרובות.
Introduction
לוקמיה לימפובלסטית חריפה (ALL) היא המחלה ממארת השכיחה ביותר בקרב ילדי 1,2. שיעור ההישרדות הכללי עבור כל ילדים B-שושלת (B-ALL) הוא כ 85%, אך תת ספציפיים ביולוגיים, כולל T-שושלת ALL (T-ALL), יש לי הפרוגנוזה עדיין עני יותר אפילו עם פרוטוקולים טיפוליים הנוכחיים. טיפול נוסף של ALL הישנות עדיין מהווה אתגר 3. למרות שהרוב המכריע של חולים מבוגרים עם לוקמיה חריפה להשיג הפוגה עם כימותרפיה-up מול, חולים רבים עדיין סובלים הישנות 4. משטרים כימותרפיות הנוכחיים בטיפול בלוקמיה חריפה ידועים כגורמים לתופעות לוואי לטווח קצר וארוך הקשורים ברעילות. לכן, טיפולים פחות רעילים שמתמקדים בתאי סרטן עם השפעה מינימאלית על רקמות נורמליות יש צורך במידה רבה. בשנים האחרונות, הושם דגש על הפיתוח של רומן, סוכנים מולקולריים ממוקדים עם סגוליות לתאי סרטן, לעתים קרובות תוך שימוש בכימיה איטרטיביכדי לייצר חומרים פעילים רבים אשר חייבים לאחר מכן להשוות ועדיף 5. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של TKIs לטיפול בלוקמיה חריפה, שניתן להשתמש בם לצורך ההערכה של תרכובת בודדת או להשוואה ישירה של תרכובות מרובות על מנת להקל על פיתוח תרופה.
השיטה המוצגת כאן מורכבת מארבעה שלבים. ראשון ביוכימי (1) ונגד לוקמיה (2) פעילות של המתחם (ים) מוערכות בתרבית תאים, ולאחר מכן עיכוב של היעד אישר בדגמים (3) בעלי חיים, ויעילות לבסוף טיפולית של TKI (ים) נקבע במודלי xenograft לוקמיה orthotopic (4). למחקרים אלה, חשוב לבחור שורות תאים רלוונטיות, שהם נציגים של תת הביולוגיים הנפוצים ביותר. שורות תאים יש לבחור, ששניהם, מבטאים את היעד של עניין ואין להם את היעד של ריבית, כדי לבדוק האם הם med השפעות ביולוגיותiated על ידי עיכוב של היעד. זה רלוונטי במיוחד לפיתוח של מעכבי מולקולה קטנים, שיש לי מחוץ יעד תופעות שעשויות להיות חשוב לפעילות אנטי סרטניים. כמו כן יש לבחור שורת תאים שתלויה ביעד להשפעות פונקציונליות, כגון ריבוי או הישרדות. מחקרים ראשוניים אימות היעד (מחוץ להיקף של מאמר זה) באמצעות התערבות RNA או באמצעים ספציפיים אחרים כדי לעכב את היעד יכולים לשמש כדי לזהות שורות תאי יעד תלוי. כמו כן, רצוי לבחור שורות תאים שיכולים ליצור xenografts העכברית, כך שתוצאות תרבית תאים יכולות להיות באופן ישיר יותר בתרגום לin vivo ניסויים.
להערכה של פעילות ביוכימית בתיווכו של TKIs בתאי סרטן דם, ירידה בזרחון הקולטן יכולה לשמש כאינדיקציה לעיכוב היעד. יכולים להיות מועסקים מבחני ניתוח כתם מערבי או ELISA, בהתאם לזמינות והספציפיות של נוגדנים.אם נוגדנים עם סגוליות מספיק ליעד זמינים, מבחני ELISA עדיפים כפי שהם יותר כמוני ויעילים. במקרים בהם נוגדנים עם סגוליות מספיק עבור ELISA אינם זמינים, ניתוח כתם מערבי עשוי להיות נחוץ. במקרה זה, immunoprecipitation של כמות גדולה של lysate יכולה להיות שימושית לזיהוי של מטרות שנמצאות בשפע נמוך. גישה זו היא רלוונטית במיוחד למדידת phospho-חלבונים, אשר עשוי להיות זמן מחצית חיים קצרים, כדי לאפשר לשינויים מהירים באיתות בתגובה לגירויים סביבתיים. כמה חלבוני פוספורילציה הם יציבים מאוד, סביר להניח כתוצאה מהיווצרות מורכבת עם phosphatases. לגילוי חזק ועקבי של חלבוני פוספורילציה האלה, זה יכול להיות גם אפשרי לטיפול בתאים עם pervanadate, מעכב החלבון phosphatase-טירוזין בלתי הפיך 6, כדי לייצב את phospho החלבון לפני הכנת lysates תא כולו.
אללקבוע אם פעילות ביוכימית תוצאות בהשפעות אנטי סרטניים, ניתן לנטר תהליכים ביולוגיים היעד תלוי בניסויים מבוססי תאים. לשורות תאי סרטן דם, פעילות אנטי לוקמיה בתיווכו של TKIs ניתן להעריך באמצעות מבחני הקמת המושבה בוצעו בmethylcellulose או רך אגר 7. אגר רך עשויים להיות מועדף כמו זה הוא מדיום מוצק כי הוא יותר נוח למניפולציה אם טיפול חוזר ונשנה עם TKI הוא הכרחי. בעוד רבים שורות תאים לוקמיה myloid (AML) חריפות תהווה מושבות באגר רך, רוב כל שורות תאים רק ליצור מושבות בmethylcellulose, שהיא מדיום מוצק למחצה. למרות שניתן לרענן בינוני ו / או TKIs בתרבויות methylcellulose, ניתן להשתמש בם רק בנפחים קטנים ובתדירות מוגבלת. כמו כן, קשה יותר כדי להכתים מושבות מבלי לשבש אותם בmethylcellulose. מחקרים ראשוניים צריכים להגדיר את היכולת של שורות תאים מתאימות כדי ליצור מושבות בmethylcellulose ו / או אגר ולא רכיםהוא צפיפות אופטימלית של תאים בתרבית כך שהמושבות הן שאינן חופפות ובמספר מספיק כדי להשיג סטטיסטי הנתונים רלוונטיים (בדרך כלל 50-200 מושבות בכל צלחת 35 מ"מ).
בעוד שבמבחני חוץ גופית הם חזקים וחסכוניים, ויש פחות השלכות אתיות מאשר ניסויים בבעלי חיים כולו, קידום של תרכובות טיפוליות דורשת הוכחת היעילות ובטיחות במודלים של בעלי חיים. במחקרי vivo, שורות תאים לוקמיה חריפות אנושיות ניתן להשתיל orthotopically לSCID NOD.Cg-Prkdc אני l2rg tm1Wjl / SzJ עכברים (NSG) וTKIs יכולים להינתן בקלות על ידי הזרקה או gavage האוראלי. שורות תאים מסוימות עשויות לדרוש חשיפה של עכברי NSG למנת שורה תלויה נמוכה של קרינה סלולרי על מנת שxenografts להקים, ובמקרה הזה עכברים לא יכולים לסבול gavage האוראלי ללא תקופת ההחלמה 5-10 יום שלאחר הקרנה. כתב יד זה מתאר דור של B-ALL ו-T-ALL xenografts באמצעותקווי תאים ספציפיים (697 וJurkat) כדוגמאות אבל xenografts ניתן להקים בעכברי NSG תוך שימוש במגוון רחב של שורות תאים. במקרה ששורות תאים אחרים הן ישימות יותר, הדרישה להקרנה, מספר אופטימלי של תאים להשתלה, ועיתוי של תחילת מחלה והתקדמות צריכה להיקבע באופן ניסיוני. באופן אידיאלי, דגמים אלה יהיו penetrance מלאה (כל בעל חיים המושתלים מתפתח לוקמיה), קינטיקה העקבית (לוקמיה מתקדמת באופן דומה בכל בעלי החיים), וחלון טיפול סביר (באופן אידיאלי 20-30 ימים שבין תחילת טיפול וההסרה ממחקר בשל מחלה) . מספר התאים המושתלים יכול להיות מוגבר כדי לשפר penetrance ועקביות קינטית או ירד כדי לשפר את חלון הטיפול במידת צורך.
כדי לקבוע אם TKIs לתווך עיכוב יעד in vivo, דגימות שנאספו מעכברים עם xenografts לוקמיה לאחר טיפול עם TKI או כלי רכב בלבד. באופן אידיאלי, במינוןלוח הזמנים של ד של ממשל לניסויים אלה מודרכים על ידי מחקרי פרמקוקינטיקה, אשר לעתים קרובות יכול להיות מבוצעים על ידי מעבדות מסחריות ומחוץ להיקף של מאמר זה. אם הנתונים הפרמקוקינטי זמינים, הריכוז של תרכובת הנדרשת לעיכוב יעיל יעד בתרבית תאים והריכוז בסרום המרבי הבאים מנה בודדת של TKI ניתן להשתמש כדי להגדיר את המינון ההתחלתי למחקרים בבעלי חיים. מחקרי פרמקוקינטיקה גם יכולים ליידע את העיתוי של איסוף דגימה לאחר טיפול ללימודי pharmacodynamic והתוואי של ממשל. עיכוב של היעד ניתן להעריך בכל איבר מושפע אך רקמות שנאספות בקלות ומעובד עדיפות. שורות תאים לוקמיה חריפות ביותר להקים בכבד, מח עצם, במערכת העצבים המרכזית הטחול, דם היקפי, ואף האיברים הספציפיים השפיעו ואת מידת קליטתם באיברים אלה משתנה בין דגמים. הפרוטוקול המובא כאן מעריך phosphעיכוב o-חלבון במח עצם באמצעות ניתוח כתם מערבי, אבל איברים מוצקים עשוי להיות קל יותר למסוק באופן עקבי ודורש עיבוד מינימאלי או לא לפני ההקפאה, ומאפשר פחות הזדמנויות לשפלה של phospho-חלבונים במהלך איסוף דגימה ועיבוד. גם אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש כדי להעריך את גידולים או איברים מושפעים מלוקמיה מוצקים.
לבסוף, היעילות הטיפולית של TKI (ים) נקבעה במודלי xenograft לוקמיה orthotopic. למחקרים אלה, התזמון של תחילת טיפול יכול להיות מגוון, כך שהמחלה היא מבוססת יותר או פחות. טיפול עשוי להתחיל מייד לאחר השתלה למחקרים ראשוניים ולאחר מכן יעוכב במחקרים הבאים עד נטל מחלה משמעותית מזוהה משוער מודל טיפול אבחון באופן הדוק יותר. באופן אידיאלי, יש גם מודלים של בעלי החיים אלה את היכולת למדידה לא פולשנית של נטל מחלה. יש לנו אופטימיזציה שיטות לכניסתה של לוציפר הגחליליתגן ASE לתוך שורות תאים לוקמיה באמצעות חלקיקים כמו וירוס, המאפשר ניתוח לא פולשני, אורך של התפרצות מחלה והתקדמות והערכה של נטל מחלה במח עצם ובאיברים מוצקים. קריטי לגישה זו הוא השימוש בשורות תאים מתויג לוציפראז חד שבטיים למניעת שונות בהתפתחות של לוקמיה-להביע לוציפראז הקשורים לשימוש של שורות תאי polyclonal ואינו קשור לטיפול בTKI 8.
יחדיו, יכולים לשמש את השלבים הבאים להערכת TKI בודד או להשוואה ודירוג ישירים של TKIs מרובה. בעוד הפרוטוקולים שהוצגו כאן מתמקדים בפיתוח של TKIs, ניתן להתאים שיטות אלה למטרות אחרות ושיקולים לפיתוח assay מתוארים. לפיכך, אסטרטגיה זו עשויה להיות רחבה יותר ישים להערכה טרום הקלינית של סוכנים ממוקדים מולקולריים לטיפול בלוקמיה חריפה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה של מעכבי טירוזין קינאז רומן בטיפול בלוקמיה חריפה. שימוש בגישה זו, פעילויות ביוכימיות ונגד לוקמיה מוערכות ראשונה במבחנים מבוססי תאים במבחנה ולאחר מכן במודלי xenograft in vivo. ניתוח immunoblot נוצל בהצלחה כדי להדגים עיכוב של טירוזין …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
בתחום ההדמיה vivo בוצע באמצעות משותפים המשאבים IVIS באוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30-CA046934 מענק). cytometry הזרימה בוצע בcytometry הזרימה משותף המשאבים, אוניברסיטת קולורדו במרכז הסרטן (נתמך על ידי P30CA046934 מענק). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1CA137078 לDKG). ABLS הוא עמית של תכנית הפיתוח של מדען הילדים, נתמכת על ידי מענקים מהאקדמיה האמריקנית לרפואת הילדים, האגודה האמריקנית לרפואת הילדים, ומכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
