एक्यूट ल्यूकेमिया के इलाज के लिए tyrosine kinase inhibitors के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन
Summary
रिसेप्टर tyrosine kinases ectopically कई तरह के कैंसर में व्यक्त कर रहे हैं और तीव्र लेकिमिया में चिकित्सकीय लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है. इस पांडुलिपि तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए tyrosine kinase inhibitors के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन है.
Abstract
रिसेप्टर tyrosine kinases ल्यूकेमिया और ठोस ट्यूमर दोनों सहित कई तरह के कैंसर के विकास और प्रगति में शामिल किया गया है, और आकर्षक druggable चिकित्सकीय लक्ष्य कर रहे हैं. यहाँ हम तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में tyrosine kinase inhibitors (TKIs) के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल चार कदम रणनीति का वर्णन. प्रारंभ में, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण सुसंस्कृत ल्यूकेमिया कोशिकाओं में लक्ष्य निषेध पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्रियात्मक गतिविधि तो methylcellulose या नरम अगर संस्कृतियों में clonogenic assays का उपयोग मूल्यांकन किया है. सेल संस्कृति assays में गतिविधि प्रदर्शित करता है कि प्रायोगिक यौगिकों मानव ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों के साथ orthotopically प्रत्यारोपित इशारा-SCID गामा (एनएसजी) चूहों का उपयोग vivo में मूल्यांकन कर रहे हैं. प्रारंभिक vivo में pharmacodynamic पढ़ाई अस्थि मज्जा से अलग leukemic विस्फोटों में लक्ष्य निषेध का मूल्यांकन. यह दृष्टिकोण प्रभावी रोकना लक्ष्य के लिए आवश्यक प्रशासन की खुराक और समय निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता हैआयन. बाद के अध्ययन जिससे एक में vivo bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर ल्यूकेमिया बोझ और चिकित्सकीय प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के गैर इनवेसिव bioluminescent निगरानी के लिए अनुमति देता है, luciferase ल्यूकेमिया कोशिकाओं को व्यक्त उपयोग vivo में TKIs की प्रभावकारिता का मूल्यांकन. इस रणनीति में इन विट्रो और इन विवो में TKIs के मूल्यांकन के लिए प्रभावी कर दिया गया है और चिकित्सीय क्षमता के साथ molecularly लक्षित एजेंटों की पहचान के लिए या कई यौगिकों का प्रत्यक्ष तुलना और प्राथमिकता के लिए लागू किया जा सकता है.
Introduction
तीव्र लिम्फोब्लासटिक लेकिमिया (सभी) बच्चों 1,2 में सबसे आम द्रोह है. बाल चिकित्सा बी वंश सब (बी सभी) के लिए समग्र जीवित रहने की दर लगभग 85% है, लेकिन टी वंश सब (टी सभी) सहित विशिष्ट जैविक उपप्रकार, यहां तक कि वर्तमान चिकित्सकीय प्रोटोकॉल के साथ अभी भी गरीब पूर्वानुमान है. Relapsed सब के आगे के इलाज के लिए एक चुनौती 3 बनी हुई है. तीव्र लेकिमिया के साथ वयस्क रोगियों के बहुमत अप सामने रसायन चिकित्सा के साथ एक छूट प्राप्त है, कई रोगियों को अब भी डूबने 4 ग्रस्त हैं. तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में वर्तमान chemotherapeutic regimens विषाक्तता से जुड़े लघु और लंबी अवधि के दुष्प्रभाव का कारण जाना जाता है. इसलिए, विशेष रूप से सामान्य ऊतकों पर न्यूनतम प्रभाव के साथ कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित है कि कम विषाक्त उपचारों बहुत जरूरत है. हाल के वर्षों में, जोर उपन्यास, कैंसर की कोशिकाओं के लिए विशिष्टता के साथ molecularly लक्षित एजेंटों, अक्सर चलने का रसायन शास्त्र के उपयोग के विकास पर रखा गया हैतब की तुलना में और 5 प्राथमिकता के आधार पर किया जाना चाहिए, जो कई सक्रिय यौगिकों उत्पन्न करने के लिए. इस पांडुलिपि नशीली दवाओं के विकास को सुविधाजनक बनाने के क्रम में एक ही परिसर के मूल्यांकन के लिए या कई यौगिकों का प्रत्यक्ष तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए TKIs के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन है.
यहाँ प्रस्तुत विधि चार चरण होते हैं. सबसे पहले जैव रासायनिक (1) और विरोधी ल्यूकेमिया (2) यौगिक (ओं) की गतिविधियों सेल संस्कृति में मूल्यांकन कर रहे हैं, तो लक्ष्य के निषेध के पशु मॉडल (3) में पुष्टि की, और TKI (एस) के अंत में चिकित्सीय प्रभावकारिता है orthotopic ल्यूकेमिया xenograft मॉडल में निर्धारित किया जाता है (4). इन अध्ययनों के लिए, यह सबसे आम जीवविज्ञान उपप्रकार के प्रतिनिधि हैं जो प्रासंगिक सेल लाइनों, का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. सेल लाइनों जीवविज्ञान प्रभाव मेड कर रहे हैं कि क्या जांच करने के लिए, दोनों, ब्याज के लक्ष्य को व्यक्त करने और ब्याज के लक्ष्य की कमी है, जो चयनित किया जाना चाहिएलक्ष्य का निषेध करके iated. यह विरोधी ट्यूमर गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है कि बंद लक्ष्य प्रभाव है जो छोटे अणु inhibitors के विकास के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. यह इस तरह के प्रसार या अस्तित्व के रूप में कार्यात्मक प्रभाव के लिए लक्ष्य पर निर्भर है कि एक सेल लाइन का चयन करने के लिए भी आवश्यक है. लक्ष्य को बाधित करने के लिए शाही सेना के हस्तक्षेप या अन्य विशिष्ट साधन का उपयोग कर (इस लेख के दायरे के बाहर) प्रारंभिक लक्ष्य सत्यापन अध्ययन लक्ष्य पर निर्भर सेल लाइनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह सेल संस्कृति परिणाम और अधिक सीधे vivo में प्रयोगों के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि इस तरह murine xenografts, फार्म कर सकते हैं कि सेल लाइनों का चयन करने के लिए भी वांछनीय है.
ल्यूकेमिया कोशिकाओं में TKIs द्वारा मध्यस्थता जैव रासायनिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए, रिसेप्टर phosphorylation में कमी लक्ष्य निषेध का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण या एलिसा assays एंटीबॉडी की उपलब्धता और विशिष्टता के आधार पर नियोजित किया जा सकता है.लक्ष्य के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, तो वे अधिक मात्रात्मक और कुशल हैं, एलिसा assays बेहतर कर रहे हैं. एलिसा के लिए पर्याप्त विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं जहां मामलों में, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण आवश्यक हो सकता है. इस मामले में, lysate की एक बड़ी राशि की immunoprecipitation कम बहुतायत में हैं कि लक्ष्यों का पता लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है. यह दृष्टिकोण पर्यावरण उत्तेजनाओं के जवाब में संकेत में तेजी से बदलाव के लिए अनुमति देने के लिए एक कम आधा जीवन हो सकता है जो phospho-प्रोटीन की माप के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. कुछ phosphorylated प्रोटीन, बेहद अस्थिर फास्फेटेजों साथ जटिल गठन का एक परिणाम के रूप में सबसे अधिक संभावना है. इन phosphorylated प्रोटीन की मजबूत और लगातार पता लगाने के लिए, यह भी पिछले पूरे सेल lysates की तैयारी करने के लिए phospho प्रोटीन को स्थिर करने के लिए, pervanadate, एक अपरिवर्तनीय प्रोटीन tyrosine फॉस्फेट अवरोध करनेवाला 6 के साथ कोशिकाओं का इलाज संभव हो सकता है.
तकजैव रासायनिक गतिविधि विरोधी ट्यूमर प्रभाव में परिणाम है कि यह निर्धारित, लक्ष्य पर निर्भर जैविक प्रक्रियाओं सेल आधारित प्रयोगों में नजर रखी जा सकती है. ल्यूकेमिया सेल लाइनों के लिए, TKIs द्वारा मध्यस्थता लेकिमिया विरोधी गतिविधि methylcellulose या नरम अगर 7 में प्रदर्शन कॉलोनी गठन assays का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता. इस एक TKI के साथ दोहराया उपचार आवश्यक है यदि हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है कि एक ठोस माध्यम के रूप में नरम अगर पसंद किया जा सकता. कई तीव्र myloid ल्यूकेमिया (एएमएल) सेल लाइनों नरम अगर में कालोनियों के रूप में करते हैं, सबसे सभी सेल लाइनों केवल एक अर्द्ध ठोस माध्यम है, जो methylcellulose में कालोनियों बनेगी. यह methylcellulose संस्कृतियों में मध्यम और / या TKIs ताज़ा करने के लिए संभव है, केवल छोटी मात्रा में इस्तेमाल किया और सीमित आवृत्ति के साथ किया जा सकता है. इसी प्रकार, यह methylcellulose में उन्हें बिना बाधा पहुँचा कालोनियों दाग अधिक मुश्किल है. प्रारंभिक अध्ययन methylcellulose और / या नरम अगर और टी में कालोनियों के रूप में करने के लिए उचित सेल लाइनों की क्षमता को परिभाषित करना चाहिएवह संस्कृति में कोशिकाओं का इष्टतम घनत्व कालोनियों गैर अतिव्यापी हैं और पर्याप्त संख्या में (35 मिमी प्लेट प्रति आम तौर पर 50-200 कालोनियों) सांख्यिकीय प्रासंगिक डेटा प्राप्त करने के लिए कि इस तरह के.
इन विट्रो assays मजबूत और लागत प्रभावी रहे हैं, और जबकि पूरे पशु प्रयोगों, चिकित्सकीय यौगिकों की उन्नति से कम नैतिक प्रभाव पशु मॉडल में प्रभावकारिता और सुरक्षा के सबूत की आवश्यकता है. Vivo अध्ययन के लिए, मानव तीव्र लेकिमिया सेल लाइनों orthotopically मैं tm1Wjl / SzJ (एनएसजी) चूहों और TKIs आसानी इंजेक्शन या मौखिक नलिका – पोषण द्वारा प्रशासित किया जा सकता l2rg NOD.Cg-Prkdc SCID में प्रत्यारोपित किया जा सकता है. कुछ सेल लाइनों xenografts स्थापित करने के लिए आदेश में विकिरण का एक कम सेल लाइन पर निर्भर खुराक के लिए परमाणु आपूर्तिकर्ता समूह के चूहों के निवेश की आवश्यकता हो सकती है, और इस उदाहरण में चूहों एक 5-10 दिन वसूली की अवधि के बाद विकिरण के बिना मौखिक नलिका – पोषण बर्दाश्त नहीं कर सकता है. इस पांडुलिपि का उपयोग बी सब और टी सभी xenografts की पीढ़ी का वर्णनउदाहरण लेकिन xenografts के रूप में विशेष सेल लाइनों (697 और Jurkat) सेल लाइनों की एक विस्तृत विविधता का उपयोग एनएसजी चूहों में स्थापित किया जा सकता है. अन्य सेल लाइनों अधिक लागू कर रहे हैं कि घटना में, विकिरण के लिए आवश्यकता, प्रत्यारोपण, और रोग शुरुआत प्रगति के समय से कोशिकाओं के इष्टतम संख्या प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए. आदर्श रूप में, इन मॉडलों (बीमारी के कारण आदर्श 20-30 दिनों के अध्ययन से उपचार और हटाने की दीक्षा के बीच) पूर्ण penetrance (प्रतिरोपित हर जानवर ल्यूकेमिया विकसित करता है), लगातार कैनेटीक्स (ल्यूकेमिया सभी जानवरों में इसी प्रकार की प्रगति), और एक उचित उपचार खिड़की होगा . प्रतिरोपित कोशिकाओं की संख्या penetrance और गतिज स्थिरता में सुधार करने के लिए वृद्धि हुई है या यदि आवश्यक उपचार खिड़की में सुधार करने के लिए कम किया जा सकता है.
TKIs vivo में लक्ष्य निषेध मध्यस्थता निर्धारित करने के लिए, नमूने TKI या केवल वाहन के साथ उपचार के बाद ल्यूकेमिया xenografts के साथ चूहों से एकत्र कर रहे हैं. आदर्श रूप में, खुराक एकइन प्रयोगों के लिए प्रशासन की डी अनुसूची अक्सर वाणिज्यिक प्रयोगशालाओं द्वारा प्रदर्शन किया और इस लेख के दायरे से बाहर किया जा सकता है जो pharmacokinetic अध्ययन, द्वारा निर्देशित कर रहे हैं. Pharmacokinetic डेटा उपलब्ध हैं, TKI की एक खुराक निम्नलिखित सेल संस्कृति में प्रभावी लक्ष्य निषेध और अधिकतम सीरम एकाग्रता के लिए आवश्यक यौगिक की एकाग्रता जानवरों के अध्ययन के लिए एक प्रारंभिक खुराक को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Pharmacokinetic अध्ययन भी pharmacodynamic अध्ययन और प्रशासन के मार्ग के लिए नमूना संग्रह के बाद इलाज के समय को सूचित कर सकते हैं. लक्ष्य का निषेध किसी भी प्रभावित अंग में मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन सबसे अधिक आसानी से एकत्र की है और कार्रवाई की जाती है कि ऊतकों बेहतर कर रहे हैं. विशिष्ट अंग प्रभावित हालांकि सबसे तीव्र लेकिमिया सेल लाइनों, जिगर, अस्थि मज्जा, प्लीहा, परिधीय रक्त, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में स्थापित करने और इन अंगों में engraftment की हद मॉडल के बीच होती है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल Phosph का आकलनO-प्रोटीन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग अस्थि मज्जा में निषेध है, लेकिन ठोस अंगों लगातार फसल के लिए आसान हो सकता है और नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान phospho प्रोटीन की गिरावट के लिए अवसर कम है, की अनुमति से पहले ठंड के लिए कम या कोई संसाधन की आवश्यकता हो सकती है. Immunohistochemistry भी ठोस ट्यूमर या ल्यूकेमिया से प्रभावित अंगों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
अंत में, TKI (एस) के चिकित्सीय प्रभावकारिता orthotopic ल्यूकेमिया xenograft मॉडल में निर्धारित किया जाता है. इन अध्ययनों के लिए, इलाज दीक्षा के समय रोग अधिक या कम की स्थापना की है कि इस तरह के, अलग किया जा सकता है. प्रारंभिक उपचार के अध्ययन के लिए प्रत्यारोपण के बाद तुरंत शुरू कर सकते हैं और उसके बाद महत्वपूर्ण रोग बोझ और अधिक बारीकी से एक नैदानिक उपचार मॉडल लगभग करने के लिए पता चला है जब तक अनुवर्ती अध्ययन में देरी हो. आदर्श रूप में, इन पशु मॉडल भी रोग बोझ का माप गैर इनवेसिव के लिए क्षमता है. हम जुगनू लूसिफ़ेर की शुरूआत के लिए तरीकों अनुकूलित हैबीमारी की शुरुआत और अस्थि मज्जा और ठोस अंगों में रोग बोझ की प्रगति और मूल्यांकन की गैर इनवेसिव, अनुदैर्ध्य विश्लेषण के लिए अनुमति वायरस की तरह कणों का उपयोग ल्यूकेमिया कोशिका लाइनों में एएसई जीन,. इस दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण पॉलीक्लोनल सेल लाइनों का उपयोग के साथ जुड़े luciferase व्यक्त ल्यूकेमिया के विकास में परिवर्तनशीलता को रोकने के लिए मोनोक्लोनल luciferase टैग सेल लाइनों का इस्तेमाल होता है और एक TKI 8 के साथ इलाज के लिए असंबंधित है.
साथ में ले ली, इन चरणों का एक भी TKI के मूल्यांकन के लिए या एकाधिक TKIs की प्रत्यक्ष तुलना और रैंकिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल TKIs के विकास पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इन तरीकों में अन्य लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और परख विकास के लिए विचार वर्णित हैं. इस प्रकार, इस रणनीति तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज के लिए और अधिक मोटे तौर पर लागू molecularly लक्षित एजेंटों के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन करने के लिए हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि तीव्र ल्यूकेमिया के इलाज में उपन्यास tyrosine kinase inhibitors के मूल्यांकन के लिए एक प्रभावी रणनीति का वर्णन है. इस दृष्टिकोण का उपयोग, जैव रासायनिक और विरोधी ल्यूकेमिया गतिविधियों में इन विट्रो से…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vivo इमेजिंग में कोलोराडो कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय में IVIS साझा संसाधन (अनुदान P30-CA046934 द्वारा समर्थित) का उपयोग किया गया था. फ्लो फ्लो साझा संसाधन, कोलोराडो कैंसर सेंटर के विश्वविद्यालय (अनुदान P30CA046934 द्वारा समर्थित) पर प्रदर्शन किया गया था. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (DKG को RO1CA137078) द्वारा समर्थित किया गया था. ABLS बाल रोग अमेरिकन अकादमी, अमेरिकन बाल चिकित्सा सोसायटी, और बाल स्वास्थ्य और मानव विकास (K12-HD000850) Eunice कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित बाल वैज्ञानिक विकास कार्यक्रम, के एक साथी है.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
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