급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가
Summary
수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.
Abstract
수용체 티로신 키나아제는 백혈병과 고형 종양을 모두 포함하여 많은 암의 발전과 진행에 연루되어 있고, 매력적인 druggable 치료 표적입니다. 여기에 우리가 급성 백혈병의 치료에 티로신 키나제 억제제 (TKIs)의 전 임상 평가를위한 효율적인 네 단계의 전략을 설명합니다. 처음에, 웨스턴 블롯 분석은 배양 된 백혈병 세포의 대상 억제를 확인하는 데 사용됩니다. 기능적인 활동은 다음 메틸 또는 부드러운 한천 문화 클론 원성 분석을 사용하여 평가됩니다. 세포 배양 분석 활동을 보여 실험 화합물은 인간의 백혈병 세포 라인 orthotopically 이식 NOD-SCID-감마 (NSG) 마우스를 사용하여 생체 내에서 평가됩니다. 초기의 생체 내 약력 학적 연구는 골수에서 분리 백혈병 폭발에 표적 억제를 평가한다. 이 방법은 효과적인 표적 억제에 필요한 투여 량 및 스케줄을 결정하는 데 사용이온. 후속 연구함으로써 생체 내 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 백혈병 부담과 치료 반응의 평가의 비 침습적 모니터링 생물 발광을 허용 루시퍼 백혈병 발현 세포를 사용하여 생체 내에서 TKIs의 효능을 평가한다. 이 전략은 시험 관내 및 생체 내에서 TKIs의 평가에 효과가있다 및 치료 가능성을 가진 분자 타겟 에이전트의 식별을 위해 또는 여러 화합물의 직접적인 비교 및 우선 순위에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
급성 림프 구성 백혈병 (ALL)은 아이들 1,2에서 가장 흔한 악성 종양이다. 소아 B-계보 ALL (B-ALL)의 생존율은 약 85 %이지만, T-혈통 ALL (T-ALL) 등의 특정 생물 학적 아형, 심지어 현재의 치료 프로토콜을 여전히 가난한 예후가. 재발 ALL의 추가 처리는 도전 3 남아있다. 급성 백혈병 성인 환자의 대부분은 선행 화학 요법과 죄 사함을 얻을 수 있지만, 많은 환자는 여전히 재발 사를 겪고 있습니다. 급성 백혈병의 치료에 현재 항암 요법은 관련 독성 장단기 부작용을 일으키는 것으로 알려져있다. 그러므로, 구체적으로 정상 조직에 최소한의 효과 암세포를 표적으로 덜 독성 요법이 크게 요구된다. 최근 강조 신규 암세포에 대한 특이성 분자 타겟 에이전트 종종 반복적 인 화학을 이용하여 개발에 배치되었습니다다음에 비해 5 우선 순위를해야합니다 여러 활성 화합물을 생성 할 수 있습니다. 이 원고는 약물 개발을 용이하게하기 위해 하나의 화합물의 평가를 위해 또는 다중 화합물의 직접 비교에 사용될 수있는 급성 백혈병의 치료를위한 TKIs의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.
여기에 제시된 방법은 네 단계로 구성되어 있습니다. 순 생화학 (1) 및 항 백혈병 (2) 화합물 (들)의 활동이 세포 배양에서 평가되고, 그 다음 대상의 억제는 동물 모델 (3)에서 확인하고, TKI 해제 최종적 치료 효능된다 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다 (4). 이들 연구의 경우, 가장 일반적인 생물학적 아형의 대표이다 중요한 세포주를 선택하는 것이 중요하다. 셀 라인은 생물학적 효과 의대 여부를 조사하기 위해, 모두가 관심의 대상을 표현하고 관심의 대상이 결여 된, 선택해야대상의 억제에 의해 iated. 이것은 항 종양 활성을 위해 중요 할 수있다 표적 이탈 효과가 소분자 저해제의 개발에 특히 적합하다. 그런 증식 또는 생존 등의 기능 효과의 대상에 의존하는 세포 라인을 선택하는 것이 필요하다. 타겟을 억제하는 RNA 간섭 또는 다른 특정 수단을 사용하여 (이 문서의 범위 밖) 예비 타겟 검증 연구는 타겟 종속 세포주를 식별하기 위해 사용될 수있다. 그것은 세포 배양 결과는 더 직접적 생체 내 실험으로 변환 될 수 있도록 뮤린 이종 이식편을 형성 할 수있는 세포주를 선택하는 것이 바람직하다.
백혈병 세포에 의해 매개 TKIs 생화학 적 활성의 평가를 위해, 수용체 인산화의 감소는 표적 억제의 지표로서 사용될 수있다. 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA 분석법 항체의 가용성 및 특이성에 따라 채용 될 수있다.대상에 대한 충분한 특이 항체를 사용할 수있는 경우가 더 많은 양적 효율적으로, ELISA 분석 실험이 바람직하다. ELISA에 충분 특이 항체를 사용할 수없는 경우, 웨스턴 블롯 분석이 필요할 수 있습니다. 이 경우, 해물 많은 양의 면역 낮은 풍부에있는 표적의 탐지에 유용 할 수 있습니다. 이 방법은 환경 자극에 대한 응답으로 신호의 급격한 변화를 허용하는 짧은 반감기를 가질 수있다 인산화 단백질의 측정에 특히 적합합니다. 일부 인산화 단백질은 매우 불안정한 포스파타제와 함께 복합체 형성의 결과로 가장 가능성이 높다. 이러한 인산화 된 단백질의 강력하고 일관된 검출을 위해, 또한 종래 전체 세포 용 해물의 제조에 인산화 단백질을 안정화시키기 위해, pervanadate, 비가역 단백질 티로신 포스파타제 억제제 (6)로 세포를 처리하는 것이 가능할 수있다.
에생화학 적 활성은 항 종양 효과가 발생하는지 여부를 결정, 대상에 의존하는 생물 학적 과정은 세포 기반 실험에서 모니터링 할 수 있습니다. 백혈병 세포주, TKIs 의해 매개 항 – 백혈병 활성은 메틸 또는 소프트 한천 7에서 수행 콜로니 형성 어 세이를 사용하여 평가 될 수있다. 이 TKI 반복 치료가 필요한 경우 조작에 더 많은 의무가 고체 배지처럼 부드러운 한천이 바람직 할 수있다. 많은 급성 myloid 백혈병 (AML) 세포 라인은 소프트 아가에서 콜로니를 형성하는 동안, 대부분의 ALL 세포주는 반고체 배지 인, 메틸 셀룰로오스에서 콜로니를 형성 할 것이다. 이 메틸 셀룰로오스 배양 매체 및 / 또는 TKIs를 새로 고침 할 수 있지만, 단지 작은 볼륨은 사용 제한 주파수를 할 수 있습니다. 마찬가지로, 메틸 셀룰로오스에서 그들을 방해하지 않고 식민지를 염색하는 것이 더 어렵다. 예비 연구는 메틸 및 / 또는 소프트 한천 및 t에서 콜로니를 형성하기위한 적절한 세포주의 능력을 정의한다그는 문화에 세포의 최적의 밀도 식민지가 겹치지하고 충분한 수의 (35 mm 플레이트 당 보통 50 ~ 200 식민지) 통계적으로 관련 데이터를 얻을 수 있도록.
체외 분석 강력하고 비용 효율적인, 그리고 가지고 있지만 모든 동물 실험, 치료 화합물의 발전보다 적은 수의 윤리적 의미는 동물 모델에서 효능과 안전성의 증거가 필요합니다. 생체 내 연구의 경우, 인간의 급성 백혈병 세포주 orthotopically 내가 tm1Wjl / SZJ (NSG) 마우스 및 TKIs 쉽게 주입 또는 경구 위관 영양법으로 투여 할 수있다 l2rg NOD.Cg-Prkdc의 SCID에 이식 할 수 있습니다. 일부 세포주 이종 이식 수립하기 위해서는 방사선의 낮은 세포주에 의존 선량 NSG 마우스의 노출을 필요로 할 수 있으며,이 경우에는 마우스는 5 ~ 10 일 회복 기간 후 조사하지 않고 경구 위관을 허용하지 않을 수 있습니다. 이 원고는 사용 B-ALL과 T-ALL 이종 이식의 생성을 설명합니다예이지만 이종 이식편과 같은 특정 세포주 (697 및 된 Jurkat)은 세포주의 다양한 사용 NSG 쥐에서 설립 될 수있다. 다른 세포주가 더 적용되면 일 경우에는, 조사에 대한 요구 사항은, 이식 및 질환 발병과 진행의 타이밍 세포의 최적의 수는 실험적으로 결정되어야한다. 이상적으로,이 모델은 (인해 질병에 이상적 20-30일 연구에서 치료 및 제거의 시작 사이의) 완전한 penetrance (이식 모든 동물은 백혈병을 개발), 일관된 반응 속도 (백혈병은 모든 동물에서 유사하게 진행), 그리고 적절한 치료 창을해야합니다 . 이식 된 세포의 수는 penetrance 및 운동 일관성을 개선하기 위해 증가되거나 필요한 경우, 처리 윈도우를 개선하기 위해 감소 될 수있다.
TKIs는 생체 내에서 대상 억제를 중재 여부를 확인하려면 샘플 TKI 또는 전용 차량과 치료 후 백혈병 이종 이식 생쥐에서 수집됩니다. 이상적으로, 선량이 실험에 대한 정부의 개발 일정은 일반 상업 실험실에서 수행하고이 문서의 범위를 벗어난다 할 수 약동학 연구에 의해 인도된다. 약물 동력 학적 데이터를 사용할 경우에, TKI의 단일 용량 다음 세포 배양에 효과적인 표적 억제 및 최대 혈청 농도에 필요한 화합물의 농도는 동물 연구에 대한 초기 투여 량을 정의하기 위해 사용될 수있다. 약동학 연구는 또한 약물 역학 연구 및 투여 경로에 대한 시료 채취 후 처리의 타이밍을 알릴 수 있습니다. 표적의 억제는 영향을받는 기관에서 평가 될 수 있지만, 대부분 쉽게 수집 및 처리되는 조직이 바람직하다. 특정 장기에 영향 비록 대부분 급성 백혈병 세포주, 간, 골수, 비장, 말초 혈액 및 중추 신경계에 확립하고 이러한 장기에 생착의 정도는 모델에 따라 변화한다. 여기에 제시된 프로토콜은 phosph을 평가O-단백질의 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 골수 억제, 그러나 고체 장기 지속적으로 수확하는 것이 더 쉬울 수 및 샘플 수집 및 처리하는 동안 인산화 단백질의 분해를위한 더 적은 기회를 허용하기 전에 동결에없이 또는 최소한의 처리를 필요로 할 수있다. 면역 조직 화학은 또한 고형 종양 또는 백혈병의 영향 장기를 평가할 수있다.
마지막으로, TKI (들)의 치료 효능은 동소 백혈병 이종 이식 모델에서 결정된다. 이들 연구의 경우, 처리 개시 타이밍은 질병이 다소간 확립 될 수 있도록, 변경 될 수있다. 치료는 초기 연구를 위해 이식 후 바로 시작할 수 있습니다 다음 중요한 질병 부담이 더 밀접하게 진단 치료 모델을 대략적으로 감지 될 때까지 후속 연구에서 지연. 이상적으로,이 동물 모델은 질병 부담의 비 침습 측정에 대한 능력이있다. 우리는 반딧불이 루시퍼의 도입을위한 방법을 최적화 한질병의 발병 및 골수와 고체 장기 질병 부담의 진행과 평가의 비 침습, 종 방향 분석을 허용 바이러스 입자를 사용하여 백혈병 세포주에 ASE 유전자. 이 방법은 긴급 클론 세포주의 사용과 관련된 루시 페라 제 발현 백혈병의 개발에 변동을 방지하기 위해 모노클로 루시페라아제 – 태그 된 세포주의 사용이며 TKI 8 치료 무관하다.
이와 함께,이 단계는 하나의 TKI의 평가를 위해 또는 여러 TKIs의 직접 비교하고 순위를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜 TKIs의 개발에 초점을하지만,이 방법은 다른 대상에 적용 할 수 있으며, 분석 개발을위한 고려 사항이 설명되어 있습니다. 따라서,이 전략은 급성 백혈병의 치료에보다 광범위하게 적용 할 수있는 분자 타겟 에이전트의 전 임상 평가를 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 급성 백혈병의 치료에 신규 한 티로신 키나제 억제제의 평가를위한 효과적인 전략을 설명한다. 이 방법을 사용, 생화학 및 항 백혈병 활동은 체외에서 세포 기반 분석에서 먼저 평가 한 후 생체 내에서 이종 이식 모델에 있습니다. 면역 블롯 분석은 성공적 TKIs 치료 후 백혈병 세포에서 표적 티로신 키나아제의 저해를 입증하는 직접 세포에서 여러 화합물의 효능을 비교하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
생체 내 이미징에서 콜로라도 암 센터의 대학에서 IVIS 공유 자원 (부여 P30-CA046934에서 지원)를 사용하여 수행 하였다. 유동 세포 계측법은 유동 세포 계측법 공유 자원, 콜로라도 암 센터의 대학 (부여 P30CA046934에서 지원)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (DKG에 RO1CA137078)에 의해 부분적으로 지원되었다. ABLS 소아과의 미국 아카데미, 미국 소아과 학회 및 아동 보건 인간 발달 (K12-HD000850)의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소에서 교부금에 의해 지원되는 소아 과학자 개발 프로그램의 연구원입니다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
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