A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Summary

As tirosina quinases receptoras são ectopicamente expressa em muitos cancros e foram identificadas como alvos terapêuticos em leucemia aguda. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina cinase para o tratamento de leucemia aguda.

Abstract

As tirosina quinases receptoras tem sido implicado no desenvolvimento e progressão de muitos cancros, incluindo tanto a leucemia e tumores sólidos, e são alvos terapêuticos druggable atraentes. Aqui, descrevemos uma estratégia de quatro etapas eficiente para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase (nilotinibe e dasatinibe) no tratamento de leucemia aguda. Inicialmente, a análise de transferência de Western é usado para confirmar a inibição alvo em células de leucemia em cultura. A actividade funcional é então avaliada utilizando ensaios clonogénicos em metilcelulose ou culturas de agar mole. Os compostos experimentais que demonstram a actividade em ensaios de cultura de células são avaliados in vivo utilizando NOD-SCID-gama (NSG) ratinhos transplantados ortotopicamente com linhas de células de leucemia humana. Estudos in vivo farmacodinâmicos iniciais avaliar a inibição alvo em blastos de leucemia isoladas a partir da medula óssea. Esta abordagem é utilizada para determinar a dose e esquema de administração requerida para inibição alvo eficazião. Estudos subsequentes avaliar a eficácia do TKI in vivo utilizando células de leucemia que expressam a luciferase, permitindo assim a monitorização bioluminescente não-invasivo de carga da leucemia e de avaliação da resposta terapêutica usando um sistema in vivo de imagem de bioluminescência. Esta estratégia tem sido útil para a avaliação de inibidores da tirosina quinase, in vitro e in vivo, e pode ser aplicado para a identificação de agentes molecularmente-alvo com potencial terapêutico, ou para comparação directa e prioridades de vários compostos.

Introduction

A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é a neoplasia maligna mais comum em crianças ^1,2. A taxa de sobrevida global para pediátrico ALL linhagem B (B-ALL) é de aproximadamente 85%, mas subtipos biológicos específicos, incluindo T-linhagem ALL (T-ALL), têm prognóstico ainda mais pobre, mesmo com protocolos terapêuticos atuais. A continuação do tratamento de recaída ALL continua sendo um desafio ^3. Embora a maioria dos pacientes adultos com leucemia aguda alcançar uma remissão com antecipado quimioterapia, muitos doentes ainda sofrem de recaídas ^4. Regimes de quimioterapia correntes no tratamento de leucemia aguda são conhecidos por causar efeitos colaterais de curto e de longo prazo associada a toxicidade. Portanto, terapias menos tóxicas que visam especificamente as células cancerosas com efeito mínimo sobre os tecidos normais são bastante necessárias. Nos últimos anos, a ênfase foi colocada no desenvolvimento do romance, os agentes molecularmente-alvo com especificidade para as células cancerosas, muitas vezes utilizando química iterativopara gerar vários compostos ativos que devem então ser comparados e priorizados ^5. Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação pré-clínica de inibidores da tirosina quinase para o tratamento da leucemia aguda, o que pode ser utilizado para a avaliação de um único composto ou por comparação directa dos vários compostos, a fim de facilitar o desenvolvimento de drogas.

O método aqui apresentado consiste em quatro etapas. Primeiro o bioquímico (1) e anti-leucemia (2) actividade do composto (s) são avaliados numa cultura de células, em seguida a inibição do alvo é confirmado em modelos animais (3), e, finalmente, a eficácia terapêutica dos inibidores da tirosina quinase (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos (4). Para estes estudos, é importante a escolha de linhas celulares relevantes, que são representantes dos subtipos biológicos mais comuns. As linhas celulares devem ser selecionados, o que ambos, expressar o alvo de interesse e falta o alvo de interesse, para investigar se os efeitos biológicos são mediated por inibição do alvo. Isto é particularmente relevante para o desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas, as quais têm efeitos fora do alvo, que podem ser importantes para a actividade anti-tumoral. Também é necessário escolher uma linha de células que é dependente do alvo para efeitos funcionais, tais como a proliferação ou sobrevivência. Estudos de validação alvo preliminares (fora do âmbito deste artigo) com RNA de interferência ou de outros meios específicos para inibir o alvo pode ser usado para identificar linhas celulares dependentes de alvo. Também é desejável escolher linhagens de células que podem formar xenoenxertos de murino, de tal modo que os resultados da cultura de células pode ser mais directamente traduzidos para experiências in vivo.

Para a avaliação da actividade bioquímica mediada por inibidores da tirosina quinase em células de leucemia, uma diminuição na fosforilação do receptor pode ser usado como um indicador de inibição alvo. Análise de ELISA ou Western blot ensaios podem ser empregues, dependendo da disponibilidade e da especificidade dos anticorpos.Se os anticorpos com uma especificidade suficiente para o alvo estão disponíveis, testes de ELISA são preferíveis uma vez que são mais quantitativa e eficiente. Nos casos em que os anticorpos com uma especificidade suficiente para o ELISA não estejam disponíveis, a análise de mancha de Western podem ser necessárias. Neste caso, a imunoprecipitação de uma grande quantidade de lisado pode ser útil para a detecção de alvos que se encontram em baixa abundância. Esta abordagem é particularmente relevante para a medição de proteínas de fosfo, que podem ter uma meia-vida curta para permitir mudanças rápidas na sinalização em resposta a estímulos ambientais. Algumas proteínas fosforiladas são extremamente lábil, provavelmente como resultado da formação de complexos com fosfatases. Para a detecção robusta e consistente destes proteínas fosforiladas, pode também ser possível tratar células com pervanadato, uma proteína-tirosina-fosfatase inibidor irreversível ^6, para estabilizar a proteína fosfo antes para a preparação de lisados ​​de células inteiras.

Paradeterminar se a actividade bioquímica resulta em efeitos anti-tumorais, os processos biológicos dependentes de alvo pode ser monitorizada em ensaios baseados em células. Para as linhas celulares de leucemia, a actividade anti-leucemia mediada por inibidores da tirosina quinase pode ser avaliada através de ensaios de formação de colónias em metilcelulose realizados em agar mole ou ^7. Ágar mole podem ser preferidos como este é um meio sólido, que é mais fácil de manipulação, se o tratamento repetido com um TKI é necessário. Enquanto muitos leucemia myloid (AML) linhas de células agudas irá formar colónias em ágar mole, a maioria das linhas de células ALL apenas irá formar colónias em metilcelulose, que é um meio semi-sólido. Embora seja possível para refrescar médio e / ou inibidores da tirosina quinase, em culturas de metilcelulose, apenas pequenos volumes pode ser utilizado e com frequência limitado. Do mesmo modo, é mais difícil para corar colónias sem interromper los em metilcelulose. Estudos preliminares que define a capacidade de linhas de células adequadas para formar colónias em metilcelulose e / ou de agar mole e tele densidade ideal de células em cultura de tal forma que as colônias não são sobrepostos e em número suficiente para obter estatisticamente (geralmente 50-200 colônias por 35 milímetros placa) dados relevantes.

Enquanto ensaios in vitro são robustos e de baixo custo, e têm menos implicações éticas do que as experiências com animais inteiros, avanço de compostos terapêuticos requer prova de eficácia e segurança em modelos animais. Para estudos in vivo, as linhas celulares de leucemia aguda humana pode ser transplantado para ortotopicamente NOD.Cg-Prkdc ^SCID I l2rg ^tm1Wjl / SZJ (NSG) ratos e TKIs pode ser facilmente administrado por injeção ou por sonda oral. Algumas linhas de células podem exigir a exposição de ratos a uma dose NSG dependente da linha celular de baixo de radiação, a fim de estabelecer xenoenxertos, e, neste caso, os ratos não podem tolerar a administração por sonda oral, sem um período de recuperação de 5-10 dias pós-irradiação. Este manuscrito descreve geração de B-ALL e T-ALL xenografts usandolinhas celulares específicas (697 e Jurkat), como exemplos, mas pode ser estabelecido xenoenxertos em ratinhos NSG utilizando uma ampla variedade de linhas celulares. No caso em que outras linhas de células são mais aplicáveis, o requisito para a irradiação, o número óptimo de células para transplante, e tempo de aparecimento e progressão da doença deve ser determinada experimentalmente. Idealmente, estes modelos terão penetrância completa (todos os animais transplantados desenvolve leucemia), cinética consistentes (leucemia progride de forma semelhante em todos os animais), e uma janela de tratamento razoável (idealmente 20-30 dias entre o início do tratamento e remoção de estudo devido a doença) . O número de células transplantadas podem ser aumentados para melhorar a penetração e consistência cinética ou diminuída para melhorar a janela de tratamento, se necessário.

Para determinar se TKIs mediar a inibição alvo in vivo, as amostras são coletadas de ratos com leucemia xenografts após o tratamento com TKI ou só veículo. Idealmente, a uma dosed esquema de administração para estas experiências são guiados por estudos farmacocinéticos, que muitas vezes podem ser realizados por laboratórios comerciais e estão fora do escopo deste artigo. Se estão disponíveis dados farmacocinéticos, a concentração de composto requerida para a inibição eficaz alvo em cultura de células e a concentração máxima no soro, após uma única dose de TKI pode ser utilizado para definir uma dose de partida para estudos com animais. Os estudos farmacocinéticos também pode informar o período de recolha de amostra de pós-tratamento para os estudos farmacodinâmicos e da via de administração. A inibição do alvo pode ser avaliada em qualquer órgão afectado, mas os tecidos que são mais facilmente recolhidas e processadas são preferíveis. Linhas de células de leucemia mais agudos estabelecer no fígado, medula óssea, o baço, o sangue periférico, e o sistema nervoso central, embora os órgãos específicos afectados e a extensão do enxerto de órgãos varia entre estes modelos. O protocolo aqui apresentado avalia fosfinibição o-proteína na medula óssea através da análise de western blot, mas órgãos sólidos pode ser mais fácil para a colheita de forma consistente e exigem o mínimo ou nenhum tratamento até à congelação, permitindo que menos oportunidade para a degradação de proteínas fosfo durante a coleta e processamento das amostras. A imuno-histoquímica pode ser usada para avaliar tumores sólidos ou de órgãos atingidos por leucemia.

Finalmente, a eficácia terapêutica do TKI (s) é determinada em modelos de xenotransplante de leucemia ortotópicos. Para estes estudos, a temporização de início do tratamento pode ser variada, de modo a que a doença é mais ou menos estabelecido. O tratamento pode começar imediatamente após o transplante para os estudos iniciais e, em seguida, ser adiada em estudos subseqüentes, até que a carga da doença significativa é detectada a aproximarem mais um modelo de tratamento de diagnóstico. Idealmente, estes modelos animais também têm a capacidade de medição não invasiva da carga de doença. Nós otimizamos os métodos de introdução do lucifer vaga-lumegene ase em linhagens celulares de leucemia usando partículas semelhantes a vírus, permitindo a análise não-invasivo, longitudinal do início da doença e progressão e avaliação da carga de doença na medula óssea e órgãos sólidos. Crítico para esta abordagem é a utilização de linhas de células monoclonais etiquetados-luciferase para evitar a variabilidade no desenvolvimento de leucemia que expressam a luciferase associada com a utilização de linhas celulares policlonais e não está relacionada com o tratamento com um TKI de ^8.

Tomados em conjunto, estes passos podem ser utilizados para a avaliação de um único TKI ou por comparação direta e classificação de várias TKIs. Embora os protocolos aqui apresentados se concentrar no desenvolvimento de inibidores da tirosina quinase, estes métodos podem ser adaptados para outros objectivos e considerações para o desenvolvimento do ensaio são descritos. Assim, esta estratégia pode ser mais amplamente aplicável para a avaliação pré-clínica de agentes molecularmente-alvo para o tratamento de leucemia aguda.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais seguiu as normas regulamentares aprovadas pela Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Colorado. O protocolo foi aprovado demonstrado pela Universidade do Comité Animal Care and Use Institucional Colorado. 1. Fosfo-proteína Western Blot Preparação de lisados Linhas de células de cultura que expressam o receptor tirosina-quinase de interesse. Células colheita e placa de 3-5 x 10 6 células / amostra …

Representative Results

Os ensaios aqui apresentados avaliar os efeitos bioquímicos e funcionais mediados por TKI e pode ser utilizado para classificar novos compostos com base no grau de inibição alvo in vitro e in vivo, redução da formação de colónias, e atraso na leucemogênese em ratinhos NSG transplantado com luciferase etiquetado células de leucemia. A análise por imunotransferência foi utilizado para determinar a inibição da forma fosforilada activa da proteína alvo em células de leuc…

Discussion

Este manuscrito descreve uma estratégia eficaz para a avaliação de inibidores de tirosina-quinase novos no tratamento de leucemia aguda. Usando esta abordagem, as actividades bioquímicas e anti-leucémicas são avaliados pela primeira vez em ensaios baseados em células in vitro e, em seguida, em modelos de xenoenxerto in vivo. A análise por imunotransferência foi utilizado com êxito para demonstrar a inibição da tirosina quinase alvo em células de leucemia após o tratamento com inibidores d…

Materials

			Reagent/Material
Hydrogen Peroxide	MP Biomedicals	#02194057	GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate	Sigma	#S6508	GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol	Sigma	#M7522	GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium	ReachBio	#1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma	#M5655	GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar	BD Biosciences	#214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride	Sigma	#N6639	GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt	PerkinElmer	#122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride	Sigma	#D9542
FITC CD45	BD Bioscience	#347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control	BD Bioscience	#51-35404X-2
Gentamycin Sulfate	Sparhawk	#NDC58005-633-04
Protease Inhibitors	Roche	#11836153001
DNase	Sigma	#D4263
Protein G Beads	Invitrogen	#10-1242
Isofluran	VETONE	#NDC13985-030-60
			Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm	Nunclon	#D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm	Nunclon	#D8429-1CS
6-well plates	BD Bioscience	#353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles	Cadence science	#7956
5 ml syringe with luer-lok	BD Bioscience	#309646
GelCount automated colony counter	Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system	PerkinElmer	#IVIS200
Scout pro portable balances, scale	Ohaus	#SP202
Broome style rodent restrainer	Plas-labs	#551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm	FST	#24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics	PDI	#B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2	Monoject	#8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile	Instech	#FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe	BD Bioscience	#309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle	BD Bioscience	#329465
Extra fine bonn scissors	FST	#14084-08
Student fine scissors	FST	#91460-11
Moria ultra fine forceps	FST	#11370-40
Extra fine graefe forceps	FST	#11150-10
Scalpel handle	FST	#10003-12
Scalpel blades	FST	#10011-00