Доклинические Оценка тирозинкиназы ингибиторов для лечения острого лейкоза
Summary
Рецептор тирозинкиназы эктопически выражается в многих видов рака и были определены в качестве терапевтических мишеней в острый лейкоз. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ингибиторами тирозинкиназы для лечения острого лейкоза.
Abstract
Рецепторные тирозинкиназы были вовлечены в развитие и прогрессирование многих видов рака, в том числе как лейкемии и твердых опухолей, и являются привлекательными druggable терапевтические мишени. Здесь мы опишем эффективную стратегию из четырех шагов для доклинической оценки ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) в лечении острых лейкозов. Первоначально вестерн-блот анализ используется для подтверждения целевого торможение в культивируемых клеток лейкемии. Функциональная активность затем оценивали с помощью клоногенные анализов в метилцеллюлозы или мягких агара культур. Экспериментальные соединения, которые демонстрируют активность в клеточных анализов культуры оцениваются в естественных условиях с использованием NOD-SCID-гамма (НСГ) мышей пересаженных ортотопически с линиями клеток лейкемии человека. Первоначальные в естественных условиях фармакодинамических исследования оценки целевой ингибирование в лейкозных бластов, выделенных из костного мозга. Этот подход используется для определения дозы и схемы введения, необходимое для эффективного целевой Блокировкаионная. Последующие исследования оценить эффективность ИТК в естественных условиях с использованием люциферазу выражающее лейкозных клеток, что позволяет для неинвазивного биолюминесцентной мониторинга бремени лейкемии и оценки терапевтического ответа, используя в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции. Эта стратегия была эффективной для оценки ИТК в пробирке и в естественных условиях и может быть применен для идентификации молекулярно-целевых агентов с терапевтическим потенциалом или для прямого сравнения и определения приоритетности нескольких соединений.
Introduction
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частым злокачественным новообразованием у детей 1,2. Общая выживаемость для педиатрического B-клонов все (В-ОЛЛ) составляет около 85%, но конкретные биологические подтипы, в том числе Т-линии ВСЕ (Т-ОЛЛ), есть еще более плохой прогноз даже при нынешних терапевтических протоколов. Дальнейшее лечение рецидивов ОЛЛ остается проблемой 3. Хотя большинство взрослых пациентов с острым лейкозом достижения ремиссии при авансовые химиотерапии, многие пациенты все еще страдают рецидив 4. Текущие химиотерапевтические схемы в лечении острого лейкоза как известно, вызывают токсичности связанных краткосрочные и долгосрочные побочные эффекты. Таким образом, менее токсичные методы лечения, которые специально направлены на раковые клетки с минимальным влиянием на нормальные ткани крайне необходимы. В последние годы акцент был сделан на развитии романа, молекулярно-целевых агентов с специфичности для раковых клеток, часто с использованием итеративного химиюдля создания нескольких активных соединений, которые затем должны быть сопоставлены и приоритетных 5. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ИТК для лечения острого лейкоза, который может быть использован для оценки одного соединения или для непосредственного сравнения нескольких соединений с целью облегчения разработки лекарств.
Метод, представленный здесь состоит из четырех шагов. Во-первых биохимический (1) и анти-лейкоз (2) деятельность соединения (ий) оцениваются в клеточной культуре, то ингибирование мишени подтвержден на животных моделях (3), и, наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопической модели ксенотрансплантата лейкоз (4). Для этих исследований, важно выбрать соответствующие клеточные линии, которые являются представителями наиболее распространенных биологических подтипов. Клеточные линии должны быть выбраны, которые оба, обозначения целей интерес и не имеют цель интерес для расследования ли мед биологические эффектыiated путем ингибирования мишени. Это особенно важно для развития низкомолекулярные ингибиторы, которые имеют мимо ворот эффекты, которые могут быть важны для противоопухолевой активностью. Кроме того, необходимо выбрать клеточную линию, которая зависит от цели функциональных эффектов, таких как пролиферации или выживания. Предварительные исследования по валидации, цель (вне рамки данной статьи) с использованием РНК-интерференции или другие специальные средства для подавления цель может быть использован для выявления целевых зависит от клеточных линий. Желательно также, чтобы выбрать клеточные линии, которые могут образовывать мышиных ксенотрансплантатов, например, что результаты клеточной культуры можно более непосредственно переводятся в естественных условиях экспериментов в.
Для оценки биохимической активности, опосредованной ИТК в лейкозных клеток, снижение фосфорилирования рецептора может быть использована в качестве индикатора целевой торможения. Вестерн-блот анализ или ELISA анализы могут быть использованы, в зависимости от доступности и специфичности антител.Если антитела с достаточной специфичностью к мишени имеются, анализы ELISA, являются предпочтительными, поскольку они более количественный и эффективным. В случаях, когда антитела с достаточной специфичностью для ELISA отсутствуют, вестерн-блот анализ может быть необходимым. В этом случае иммунопреципитации из большого количества лизата может быть полезно для обнаружения целей, которые находятся в низком избытке. Такой подход особенно актуален для измерения фосфо-белков, которые могут иметь короткий период полураспада для обеспечения быстрых изменений в передаче сигналов в ответ на стимулы окружающей среды. Некоторые фосфорилированные белки чрезвычайно лабильный, скорее всего, в результате комплексообразования с фосфатаз. Для надежной и последовательной обнаружения этих фосфорилированными белков, он также может быть возможным для лечения клеток с pervanadate, необратимого белок-тирозин фосфатазы ингибитора 6, для стабилизации фосфо-белок до получения целых клеточных лизатов.
Копределить результаты ли биохимическая активность эффектов противоопухолевых, целевые зависит от биологических процессов можно наблюдать в экспериментах на основе клеток. Для лейкоз клеточных линий, анти-лейкоз деятельность опосредована ИТК можно оценить, используя образование колоний анализов, выполняемых в метилцеллюлозы или мягком агаре 7. Мягкий агар может быть предпочтительным, поскольку это является твердой среды, что является более склонны к манипуляции, если повторное лечение с ИТК необходимо. Хотя многие острые myloid лейкоз (AML) клеточные линии будут образовывать колонии в мягком агаре, большинство все клеточные линии будут только образовывать колонии в метилцеллюлоза, который представляет собой полутвердый носитель. Хотя возможно, чтобы обновить среду и / или в ИТК метилцеллюлозы культур, только небольшие объемы могут быть использованы и с ограниченной частотой. Кроме того, он является более трудным для окрашивания колоний, не нарушая их в метилцеллюлозы. Предварительные исследования должны определить способность соответствующих клеточных линий образовывать колонии в метилцеллюлозы и / или мягком агаре и тон оптимальная плотность клеток в культуре, так что колонии не перекрываются и в достаточном количестве для получения статистически соответствующие данные (обычно 50-200 колоний на 35 мм пластины).
В то время как анализы в пробирке являются надежными и экономически эффективными и имеют меньше этические последствия, чем целых экспериментах на животных, продвижения терапевтических соединений требуется доказательство эффективности и безопасности на животных моделях. Для естественных условиях исследования в, острый лейкоз человеческие клеточные линии могут быть ортотопически пересадить в NOD.Cg-Prkdc SCID я l2rg tm1Wjl / SZJ (ГЯП) мышей и ИТК могут быть легко введены путем инъекции или желудочный зонд. Некоторые клеточные линии могут потребовать экспозиции мышей NSG к низкой линии в зависимости от дозы радиации клеток для того, чтобы установить ксенотрансплантатов, и в этом случае мышей не могут переносить желудочный зонд без восстановительного периода 5-10 дней после облучения. Эта рукопись описывает поколение B-ОЛЛ и T-ВСЕХ ксенотрансплантаты помощьюконкретные клеточные линии (697) и Jurkat в качестве примеров, но ксенотрансплантатов могут быть установлены в NSG мышей с использованием широкий спектр клеточных линий. В том случае, другие клеточные линии более применимо, требование для облучения, оптимальное количество клеток к трансплантации, и времени начала заболевания и прогрессирования должны быть определены экспериментально. В идеале, эти модели будут иметь полную пенетрантность (каждое животное пересадить заболевает лейкемией), последовательные кинетики (лейкемия прогрессирует же у всех животных), и разумную окно лечения (в идеале 20-30 дней между началом лечения и снятия с изучения в связи с болезнью) . Число клеток, трансплантированных может быть увеличено, чтобы улучшить пенетрантность и кинетическую консистенцию или уменьшена для улучшения обработка окна, если это необходимо.
Чтобы определить, TKIs посредником целевой ингибирование в естественных условиях, образцы собирают из мышей с лейкемией ксенотрансплантатов после обработки ИТК или только транспортного средства. В идеале, дозад расписание администрации для этих экспериментов руководствуются фармакокинетических исследованиях, которые часто могут быть выполнены коммерческими лабораториями и выходят за рамки этой статьи. Если фармакокинетические данные доступны, концентрация соединения, необходимую для эффективного целевого торможения в культуре клеток и максимальной концентрации в сыворотке после однократной дозы ИТК может быть использован, чтобы определить начальную дозу для исследований на животных. Фармакокинетические исследования могут также информировать времени сбора проб после лечения для фармакодинамических исследований и пути введения. Торможение цели можно оценить в любом пораженного органа, но ткани, которые наиболее легко собираются и обрабатываются, являются предпочтительными. Самые острые лейкозы клеточные линии установить в печени, костном мозге, селезенке, периферической крови и центральной нервной системы, хотя конкретные поражаемые органы и степень приживления в этих органах колеблется между моделями. Протокол, представленные здесь оценивает Phosphингибирование о-белок в костном мозге с помощью Вестерн-блот анализ, но твердые органы могут быть легче последовательно собирают и требуют минимального или без обработки перед замораживанием, что позволяет меньше возможностей для деградации фосфо-белков во время сбора и обработки образца. Иммуногистохимическое также может быть использован для оценки солидных опухолей или органы, пострадавших от лейкемии.
Наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопических моделей лейкемии ксенотрансплантатных. Для этих исследований, сроки начала лечения может варьироваться, так что заболевание более или менее установлено. Лечение может начаться немедленно после трансплантации для первоначальных исследований, а затем быть отложено в последующих исследованиях, пока бремя значимом заболевании не обнаружено более тесно приблизить диагностическую модель лечения. В идеале, эти животные модели также имеют потенциал для неинвазивного измерения бремени болезней. Мы оптимизировали методы введения светлячка ЛюцифераГен азы в клеточных линиях лейкемии использованием вирусоподобные частицы, что позволяет для неинвазивного, продольной анализа начала заболевания и прогрессирования и оценки бремени болезней в костном мозге и твердых органов. Важнейшее значение для такого подхода является использование моноклональных люциферазы с метками клеточных линий, чтобы предотвратить изменчивости в развитии люциферазой выражая лейкемии, связанной с использованием поликлональных клеточных линий и не имеет отношения к лечению с ИТК 8.
Взятые вместе, эти шаги могут быть использованы для оценки одного ИТК или для прямого сравнения и ранжирования нескольких ИТК. В то время как протоколы, представленные здесь, сосредоточены на разработке ИТК, эти методы могут быть адаптированы к другим объектам и соображения, касающиеся развития анализа описаны. Таким образом, эта стратегия может быть более широкое применение в доклинических оценки молекулярно-целевых средств для лечения острого лейкоза.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описывает эффективную стратегию оценки новых ингибиторов тирозинкиназы при лечении острого лейкоза. Используя этот подход, биохимические и анти-лейкемии деятельности оцениваются сначала в клеточных анализов в пробирке, а затем в моделях ксенотрансплантатов в ес?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
В естественных изображений проводили с использованием ИВИС общего ресурса в Университете Колорадо онкологический центр (поддерживается грантом P30-CA046934). Проточной цитометрии проводили в проточной цитометрии общий ресурс, Университета Колорадо онкологический центр (при поддержке гранта P30CA046934). Эта работа была частично поддержана Национальными Институтами Здоровья (RO1CA137078 в ДКГ). ABLS является членом программы Детская Scientist развития, при поддержке грантов от Американской академии педиатрии, Американской педиатрического общества, и Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
