Evaluación previa a la clínica de inhibidores de tirosina cinasa para el tratamiento de la leucemia aguda
Summary
Los receptores tirosina quinasas se expresan ectópica en muchos tipos de cáncer y han sido identificados como dianas terapéuticas en leucemia aguda. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación pre-clínica de inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de la leucemia aguda.
Abstract
Los receptores de tirosina quinasas han sido implicados en el desarrollo y progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo tanto la leucemia y tumores sólidos, y son dianas terapéuticas druggable atractivos. Aquí se describe una estrategia de cuatro pasos eficiente para la evaluación pre-clínica de los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) en el tratamiento de la leucemia aguda. Inicialmente, el análisis de transferencia Western se usa para confirmar la inhibición de destino en células de leucemia cultivadas. La actividad funcional se evaluó después usando ensayos clonogénicos en metilcelulosa o cultivos de agar blando. Compuestos experimentales que demuestran la actividad en ensayos de cultivo de células se evaluaron in vivo utilizando ratones NOD-SCID-gamma (GSN) los ratones trasplantados ortotópicamente con líneas celulares de leucemia humana. In vivo estudios farmacodinámicos iniciales evaluar la inhibición de destino en blastos leucémicos aisladas de la médula ósea. Este enfoque se utiliza para determinar la dosis y pauta de administración requerida para la inhibición eficaz objetivode iones. Estudios posteriores Evaluar la eficacia de la TKIs en vivo utilizando luciferasa que expresan las células de leucemia, permitiendo de este modo para la supervisión bioluminiscente no invasiva de la carga de la leucemia y la evaluación de la respuesta terapéutica in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en. Esta estrategia ha sido eficaz para la evaluación de TKIs in vitro e in vivo y puede ser aplicado para la identificación de agentes dirigidos molecularmente con potencial terapéutico o para la comparación directa y la priorización de múltiples compuestos.
Introduction
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna más frecuente en los niños 1,2. La tasa de supervivencia general de los casos de LLA pediátrica de linaje B (B-ALL) es de aproximadamente 85%, pero los subtipos biológicos específicos, entre ellos T-LLA de linaje (LLA-T), que el pronóstico sigue siendo pobre, incluso con protocolos terapéuticos actuales. El tratamiento posterior de la LLA recidivante sigue siendo un desafío 3. Aunque la mayoría de los pacientes adultos con leucemia aguda lograr una remisión con quimioterapia por adelantado, muchos pacientes todavía sufren recaídas 4. Regímenes quimioterapéuticos actuales en el tratamiento de la leucemia aguda son conocidos por causar efectos secundarios a corto y largo plazo de toxicidad asociada. Por lo tanto, las terapias menos tóxicas que atacan específicamente las células cancerosas con un efecto mínimo sobre los tejidos normales son muy necesarios. En los últimos años, se ha puesto énfasis en el desarrollo de la novela, agentes molecularmente orientados con especificidad para las células cancerosas, a menudo utilizando la química iterativapara generar múltiples compuestos activos que luego deben ser comparadas y priorizaron 5. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación preclínica de ITC para el tratamiento de la leucemia aguda, que puede ser utilizado para la evaluación de un único compuesto o para la comparación directa de múltiples compuestos con el fin de facilitar el desarrollo de fármacos.
El método presentado aquí consta de cuatro pasos. En primer lugar la bioquímica (1) y anti-leucemia (2) las actividades de los compuesto (s) se evalúan en cultivo celular, a continuación, la inhibición de la diana se confirma en modelos animales (3), y, finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico (4). Para estos estudios, es importante elegir líneas celulares pertinentes, que son representantes de los subtipos biológicos más comunes. Las líneas celulares se deben seleccionar, que tanto, expresan la diana de interés y carecen de la diana de interés, para investigar si los efectos biológicos están medIATED por la inhibición de la diana. Esto es particularmente relevante para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas, que tienen fuera de objetivo efectos que pueden ser importantes para la actividad anti-tumoral. También es necesario escoger una línea celular que es dependiente de la diana para los efectos funcionales, tales como la proliferación o la supervivencia. Estudios de validación de destino preliminares (fuera del alcance de este artículo) utilizando la interferencia de ARN u otros medios específicos para inhibir el objetivo se pueden utilizar para identificar líneas de células dependiente de la diana. También es deseable elegir líneas celulares que pueden formar xenoinjertos murinos, de tal manera que los resultados del cultivo celular puede ser más directamente traducido a experimentos in vivo.
Para la evaluación de la actividad bioquímica mediada por TKIs en células de leucemia, una disminución en la fosforilación del receptor se puede utilizar como un indicador de inhibición de destino. Ensayos de análisis de transferencia de Western o ELISA se pueden emplear, dependiendo de la disponibilidad y la especificidad de los anticuerpos.Si los anticuerpos con especificidad suficiente para el objetivo están disponibles, ensayos de ELISA son preferibles ya que son más cuantitativa y eficiente. En los casos en que los anticuerpos con especificidad suficiente para ELISA no están disponibles, el análisis de transferencia Western puede ser necesario. En este caso, la inmunoprecipitación de una gran cantidad de lisado puede ser útil para la detección de objetivos que están en baja abundancia. Este enfoque es particularmente relevante para la medición de fosfo-proteínas, que pueden tener una vida media corta para permitir cambios rápidos en la señalización en respuesta a los estímulos ambientales. Algunas proteínas fosforiladas son extremadamente lábil, muy probablemente como resultado de la formación de complejos con fosfatasas. Para la detección robusto y consistente de estas proteínas fosforiladas, también puede ser posible para el tratamiento de las células con pervanadato, un inhibidor de la fosfatasa de la proteína tirosina irreversibles 6, para estabilizar el fosfato proteína antes de la preparación de lisados de células enteras.
Adeterminar si la actividad bioquímica resulta en efectos anti-tumorales, procesos biológicos dependiente de la diana se pueden monitorizar en experimentos basados en células. Para las líneas celulares de leucemia, actividad anti-leucemia mediada por TKIs se puede evaluar usando ensayos de formación de colonias realizadas en metilcelulosa o agar blando 7. Agar blando puede ser preferible, ya que es un medio sólido que es más susceptible a la manipulación, si es necesario un tratamiento repetido con un TKI. Mientras que muchas líneas celulares de leucemia aguda myloid (LMA) formarán colonias en agar blando, la mayoría de todas las líneas celulares solo se forman colonias en metilcelulosa, que es un medio semi-sólido. Aunque es posible para refrescar medio y / o TKIs en cultivos de metilcelulosa, sólo pequeños volúmenes se pueden utilizar y con frecuencia limitada. Del mismo modo, es más difícil para teñir colonias sin interrumpir en metilcelulosa. Los estudios preliminares deben definir la capacidad de líneas de células apropiadas para formar colonias en metilcelulosa y / o agar blando y Tque la densidad óptima de células en cultivo tales que las colonias no se solapan y en número suficiente para obtener datos estadísticamente relevantes (normalmente 50-200 colonias por placa de 35 mm).
Mientras que los ensayos in vitro son robustos y rentables, y tienen menos consecuencias éticas que los experimentos con animales enteros, el avance de los compuestos terapéuticos requiere prueba de eficacia y seguridad en modelos animales. Para los estudios in vivo, las líneas celulares de leucemia aguda humanos pueden ser trasplantadas en ortotópicamente NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (GSN) ratones y TKIs se pueden administrar fácilmente por inyección o una sonda nasogástrica. Algunas líneas celulares pueden requerir la exposición de ratones sin garantía soberana a una dosis baja de línea celular dependiente de la radiación con el fin de xenoinjertos de establecer, y en este caso los ratones no pueden tolerar la alimentación oral forzada sin un período de recuperación de 5 a 10 días después de la irradiación. Este manuscrito describe la generación de B-ALL y T-ALL xenoinjertos utilizandolíneas celulares específicos (697 y Jurkat) como ejemplos, pero pueden establecerse xenoinjertos en ratones GSN utilizando una amplia variedad de líneas celulares. En el caso de que otras líneas celulares son más aplicables, el requisito para la irradiación, el número óptimo de células a trasplante, y el momento de aparición de la enfermedad y la progresión se debe determinar experimentalmente. Idealmente, estos modelos tendrán penetrancia completa (cada animal trasplantado desarrolla la leucemia), la cinética consistentes (leucemia progresa de manera similar en todos los animales), y una ventana de tratamiento razonable (idealmente 20-30 días entre el inicio del tratamiento y la eliminación del estudio debido a la enfermedad) . El número de células trasplantadas se puede aumentar para mejorar la penetración y la consistencia cinética o disminuye para mejorar la ventana de tratamiento si es necesario.
Para determinar si TKIs median la inhibición diana in vivo, las muestras se obtuvieron de ratones con xenoinjertos de leucemia después del tratamiento con ITC o sólo vehículo. Idealmente, la una dosisd programa de administración para estos experimentos se guían por los estudios farmacocinéticos, que a menudo pueden ser realizados por laboratorios comerciales y están fuera del alcance de este artículo. Si se dispone de datos farmacocinéticos, la concentración de compuesto requerida para la inhibición eficaz objetivo en cultivo de células y la concentración máxima en suero después de una única dosis de TKI se puede utilizar para definir una dosis de partida para los estudios en animales. Los estudios farmacocinéticos también pueden informar al momento de la recolección de la muestra después del tratamiento para los estudios farmacodinámicos y la vía de administración. La inhibición de la diana puede evaluarse en cualquier órgano afectado, pero los tejidos que se recolectan y procesan con mayor facilidad son preferibles. Líneas celulares de leucemia más agudos establecen en el hígado, médula ósea, bazo, sangre periférica, y el sistema nervioso central, aunque los órganos específicos afectados y el grado de injerto en estos órganos varía entre modelos. El protocolo presentado aquí evalúa fosfinhibición o-proteína en la médula ósea utilizando análisis de transferencia de Western, pero órganos sólidos pueden ser más fáciles de cosechar constantemente y requieren un procesamiento mínimo o nada de antes de la congelación, lo que permite menos oportunidad para la degradación de fosfo-proteínas durante la recogida y procesamiento de la muestra. La inmunohistoquímica también se puede utilizar para evaluar tumores sólidos o órganos afectados por la leucemia.
Finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico. Para estos estudios, el momento de inicio del tratamiento puede variar, de modo que la enfermedad está más o menos establecido. El tratamiento puede comenzar inmediatamente después del trasplante para los estudios iniciales y luego se retrasó en estudios posteriores hasta que se detecta la carga de morbilidad significativa para aproximarse más a un modelo de tratamiento de diagnóstico. Idealmente, estos modelos animales también tienen la capacidad para la medición no invasiva de la carga de morbilidad. Hemos optimizado los métodos de introducción de la lucifer luciérnagaASE gen en líneas celulares de leucemia utilizando partículas similares a virus, lo que permite el análisis no invasivo, longitudinal de inicio de la enfermedad y la progresión y la evaluación de la carga de la enfermedad en la médula ósea y los órganos sólidos. Fundamental para este enfoque es el uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados monoclonales para evitar la variabilidad en el desarrollo de la leucemia que expresan luciferasa asociado con el uso de líneas celulares policlonales y no está relacionado con el tratamiento con un TKI 8.
Tomados en conjunto, estos pasos se pueden utilizar para la evaluación de una sola TKI o para la comparación directa y la clasificación de múltiples TKIs. Mientras que los protocolos presentados aquí se centran en el desarrollo de TKIs, estos métodos se pueden adaptar a otros objetivos y consideraciones para el desarrollo del ensayo se describen. Por lo tanto, esta estrategia puede ser más ampliamente aplicable a la evaluación pre-clínica de agentes dirigidos molecularmente para el tratamiento de la leucemia aguda.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito describe una estrategia eficaz para la evaluación de inhibidores de tirosina quinasa nuevos en el tratamiento de la leucemia aguda. Usando este enfoque, las actividades bioquímicas y anti-leucemia se evalúan primero en ensayos basados en células in vitro y luego en modelos de xenoinjerto in vivo. El análisis por inmunotransferencia se utilizó con éxito para demostrar la inhibición de la tirosina quinasa diana en células de leucemia después del tratamiento con TKIs y para…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Imágenes in vivo se realizó con el recurso compartido IVIS en la Universidad de Colorado Cancer Center (con el apoyo de subvención P30-CA046934). Citometría de flujo se realizó en la citometría de flujo de recursos compartidos de la Universidad de Colorado Cancer Center (apoyado por P30CA046934 subvención). Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (RO1CA137078 a DKG). ABLS es miembro del Programa de Desarrollo Pediátrico científico, apoyado por becas de la Academia Americana de Pediatría, la Sociedad Americana de Pediatría y el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
Referências
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