غشاء العمود الفقري: أداة كيميائية حيوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات للبروتينات الغشاء<em> في فيفو</em
Summary
يوصف منهج الكيمياء الحيوية في الجسم الحي لتحديد البروتين البروتين التفاعلات (PPI) للبروتينات الغشاء. أسلوب يجمع بين البروتين عبر ربط، وتنقية تقارب ومطياف الكتلة، وقابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا أو الكائن الحي. مع هذا النهج، وحتى تحديد مثبطات مضخة البروتون عابرة يصبح ذلك ممكنا.
Abstract
بروتينات الغشاء ضرورية لبقاء الخلية، وبالتالي فهي أهداف علاجية هامة 1-3. لأنها تعمل في المجمعات 4، وأساليب لتحديد وتوصيف تفاعلاتها ضرورية 5. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير بكتيريا غشاء البروتين تجربة التفاعل، ودعا غشاء العمود الفقري 6. هذا الأسلوب يجمع بين المجراة عبر ربط باستخدام عكسها عبر رابط مع الفورمالديهايد تنقية تقارب من بروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. أثناء الإجراء، والبروتينات فريسة عبر ربط والتعاون مع تنقية البروتين الطعم الغشاء ومفصولة الغليان في وقت لاحق. وبالتالي، واثنين من المهام الرئيسية التي يمكن تشغيلها عند تحليل التفاعلات البروتين البروتين (مثبطات مضخة البروتون) من بروتينات الغشاء باستخدام غشاء العمود الفقري: أولا، تأكيد وجود شريك التفاعل الذي اقترحه immunoblotting، والثانية، وتحديد الشركاء التفاعل جديدة عن طريق تحليل الطيف الكتلي . وعلاوة على ذلك، حتى لآه تقارب، مثبطات مضخة البروتون هي عابرة كشفها بواسطة هذه التقنية. أخيرا، غشاء العمود الفقري قابلة للتكيف مع ما يقرب من أي نوع من الخلايا، مما يجعلها قابلة للتطبيق كأداة فحص قوية لتحديد مثبطات مضخة البروتون من البروتينات الغشاء.
Introduction
لفهم وظيفة البروتين فمن الضروري أن نعرف شركاء تفاعلها. تتوفر لتحديد الشركاء التفاعل من بروتينات قابلة للذوبان العديد من التقنيات الكلاسيكية. ولكن هذه التقنيات ليست قابلة للتحويل بسهولة إلى غشاء البروتينات نظرا لطبيعة مسعور بهم 4. للتغلب على هذا القيد، وقد وضعنا في غشاء بكتيريا البروتين التفاعل التجربة (غشاء العمود الفقري) 6. لأنه يقوم على طريقة العمود الفقري، والتي كانت مناسبة فقط للبروتينات قابلة للذوبان 7.
فوائد غشاء العمود الفقري من اثنين من المزايا التي تتمتع بها عبر ربط كيل الفورمالديهايد: أولا، والفورمالديهايد يمكن أن تخترق بسهولة الأغشية ويولد لقطة دقيقة من interactome خلية الحية 8 بالتالي. الثانية، والفورمالديهايد عبر وصلات يمكن عكسها من الغليان 9. هنا، يتم استخدام هذه المزايا اثنين لتحديد ليس فقط مثبطات مضخة البروتون دائمة ولكن أيضا عابرة للالمتواجد الغشاء6 الإضافية.
في سطور، وتنصهر في علامة بكتيريا لمحطة سي من البروتين لا يتجزأ الطعم الغشاء. يتم تحضين الخلايا معربا عن البروتين الطعم الغشاء مع الفورمالديهايد التي عبر وصلات البروتينات فريسة للبروتين الغشاء الطعم (الشكل 1). ليست هناك حاجة للبروتينات التعديلات الفريسة. المقبل، وجزء الغشاء مستعدة. لذلك، يتم solubilized البروتينات الغشاء عن طريق العلاج المنظفات والطعم البروتينات هي التعاون مع تنقية البروتينات فريسته باستخدام تنقية تقارب. بعد ذلك، يتم عكس الرابط عبر من الغليان، ويتم فصل الطعم والبروتينات فريسة المشترك مزال من قبل SDS-PAGE. أخيرا، يمكن تحديدها من خلال تحليل البروتينات فريسة طخة مناعية أو مطياف الكتلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل الغشاء العمود الفقري هو نهج البيوكيميائية التي تمكن واحد لتأكيد وتحديد لهذه النقطة شركاء التفاعل غير معروف من البروتينات الغشاء. غشاء العمود الفقري يجمع في الجسم الحي عبر ربط بواسطة الفورمالديهايد مع تنقية البروتين الطعم غشاء الموسومة بكتيريا. الجمع مع i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث GraKo1121، Hu1011/2-1 وSFB940 إلى SH
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referências
- Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G., Sonnhammer, E. L. L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes. J. Mol. Biol. 305, 567-580 (2001).
- Bakheet, T. M., Doig, A. J. Properties and identification of human protein drug targets. Bioinformatics. 25, 451-457 (2009).
- Yildirim, M. A., Goh, K. I., Cusick, M. E., Barabasi, A. L., Vidal, M. Drug-target network. Nat. Biotechnol. 25, (2007).
- Daley, D. O. The assembly of membrane proteins into complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 420-424 (2008).
- Jung, K., Fried, L., Behr, S., Heermann, R. Histidine kinases and response regulators in networks. Curr. Opin. Microbiol. 15, 118-124 (2012).
- Müller, V. S., Jungblut, P. R., Meyer, T. F., Hunke, S. Membrane-SPINE: An improved method to identify protein-protein interaction partners of membrane proteins in vivo. Proteomics. 11, 2124-2128 (2011).
- Herzberg, C., et al. SPINE: A method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactions in vivo. Proteomics. 7, 4032-4035 (2007).
- Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. J. Mass Spectrom. 43, 699-715 (2008).
- Hernandez, P., Müller, M., Appel, R. D. Automated protein identification by tandem mass spectrometry: Issues and strategies. Mass Spectrom. Rev. 25, 235-254 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hunke, S., Keller, R., Müller, V. S. Signal integration by the Cpx-envelope stress system. FEMS Microbiol. Lett. 326, 12-22 (2012).
- Weber, R. F., Silverman, P. M. The Cpx proteins of Escherichia coli K12 : Structure of the CpxA polypeptide as an inner membrane component. J. Mol. Biol. 203, 467-478 (1988).
