막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em> 생체</em
Summary
생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 – 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.
Abstract
막 단백질은 세포 생존에 필수적이며, 따라서 중요한 치료 표적 1-3이다. 그들은 단지 4에서 작동하기 때문에, 상호 작용을 파악하고 특징 짓는 방법은 5 필요합니다. 이를 위해, 우리는 막 척추 6라고 불리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용의 실험을 개발했다. 이 기술은 연쇄상 태깅 막 미끼 단백질의 친화도 정제하여 리버시블 가교제 포름 알데히드를 사용하여 가교 생체 내에서 결합한다. 절차 중에 가교 먹이 단백질은 막 단백질을 미끼로 공동 정제이어서 비등에 의해 분리된다. 막 등뼈를 사용하여 막 단백질의 단백질 – 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)를 분석 할 때 따라서, 두 가지 주요 작업을 실행할 수 있습니다 : 첫 번째, 면역 블, 그리고에 의해 제안 된 상호 작용 파트너의 확인 번째, 질량 분석 분석에 의해 새로운 상호 작용 파트너의 식별 . 또한,도 L친화력 아야, 과도 프로톤 펌프 억제제는이 기술에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 막 척추는 막 단백질의 프로톤 펌프 억제제를 식별 할 수있는 강력한 검사 도구로 적용하고, 거의 모든 세포 유형에 적응할 수있다.
Introduction
단백질의 기능을 이해하기 위해 그것의 파트너 상호 작용을 아는 것이 필수적이다. 여러 고전적인 기술은 수용성 단백질의 상호 작용 파트너의 ID를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 소수성 4에 의한 막 단백질을 쉽게 양도 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용 실험 (막 척추) 6을 개발했습니다. 그것은 수용성 단백질 7 만 적합한 척추 방법을 기반으로합니다.
가교제의 포름 알데히드의 두 가지 장점에서 막 척추의 장점은 첫째, 포름 알데히드는 쉽게 세포막을 통과하기 때문에 살아있는 세포 8 interactome의 정확한 스냅 샷을 생성 할 수 있습니다. 둘째, 포름 알데히드 상호 링크는 9 끓는으로 되돌릴 수 있습니다. 여기서, 이러한 두 가지 이점은 멤브레인 PROTE 영구 아니라 과도 프로톤 펌프 억제제뿐만를 식별하는 데 사용기능 6.
요컨데, 패 혈성-태그가 일체형 멤브레인 미끼 단백질의 C-말단에 융합된다. 막 미끼 단백질을 발현하는 세포는 간 링크가 막 미끼 단백질로 단백질을 먹이로 포름 알데히드 (그림 1)와 함께 배양된다. 먹이 단백질의 수정은 필요하지 않습니다. 다음에, 막 분획을 제조하다. 따라서, 막 단백질은 단백질이 친화력 정화를 먹이 단백질과 공동으로 정제되어 세제 처리 및 미끼에 의해 용해된다. 이어서, 가교가 비등하여 반전되고, 미끼 및 그 공동 용출 먹이 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 마지막으로, 먹이 단백질은 면역 블롯 분석 또는 질량 분석법에 의해 확인 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
막 척추 분석을 확인하고 막 단백질의이 시점 알 수없는 상호 작용 파트너 식별을 가능하게하는 생화학 적 방법입니다. 막 척추 연쇄상 구균 태그가 막 미끼 단백질의 정제와 포름 알데히드에 의해 생체 내 가교에 결합한다. 면역 블로와의 조합은 예상 상호 작용 파트너의 확인 (그림 2)을 용이하게한다. 또한, MS의 분석과 함께 알 수없는 상호 작용 파트너의 식별 (그림 3)?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 및 SFB940의 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referências
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