Membrana-SPINE: uno strumento biochimici per identificare interazioni proteina-proteina di proteine di membrana<em> In Vivo</em
Summary
Un approccio biochimico è descritto per identificare in vivo interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine di membrana. Il metodo combina proteina reticolazione, purificazione per affinità e spettrometria di massa, ed è adattabile a qualsiasi tipo cellula o organismo. Con questo approccio, anche l'identificazione degli IPP transitori diventa possibile.
Abstract
Le proteine di membrana sono essenziali per la vitalità delle cellule e sono quindi importanti bersagli terapeutici 1-3. Dal momento che funzionano in complessi 4, sono necessari metodi per identificare e caratterizzare le loro interazioni 5. A questo scopo, abbiamo sviluppato l'esperimento di interazione Strep-proteina di membrana, denominata membrana SPINE 6. Questa tecnica combina in vivo reticolazione usando l'reversibile reticolante formaldeide con purificazione per affinità di una proteina di membrana esca Strep-tag. Durante la procedura, proteine preda reticolati sono co-purificati con la proteina esca membrana e successivamente separati mediante ebollizione. Quindi, due compiti principali possono essere eseguiti quando si analizzano le interazioni proteina-proteina (PPI) di proteine di membrana con membrana SPINE: in primo luogo, la conferma di un partner di interazione proposto da immunoblotting, e in secondo luogo, l'individuazione di nuovi partner di interazione mediante analisi di spettrometria di massa . Inoltre, anche low affinità, PPI transitori sono rilevabili da questa tecnica. Infine, membrana SPINE è adattabile a quasi ogni tipo di cellula, che lo rende applicabile come strumento di screening potente per identificare PPI di proteine di membrana.
Introduction
Per comprendere la funzione di una proteina è fondamentale conoscere i suoi partner di interazione. Diverse tecniche classiche sono disponibili per l'identificazione di partner di interazione di proteine solubili. Tuttavia, queste tecniche non sono facilmente trasferibili ad proteine della membrana a causa della loro natura idrofoba 4. Per superare questa limitazione, abbiamo sviluppato il Strep-proteina esperimento di interazione membrana (Membrane-SPINE) 6. Si basa sul metodo colonna vertebrale, che è adatto solo per le proteine solubili 7.
Benefici membrana e colonna vertebrale da due vantaggi della formaldeide agente reticolante: primo, formaldeide possono facilmente penetrare le membrane e quindi genera un'istantanea precisa dell'interattoma di una cellula vivente 8. In secondo luogo, formaldeide cross-link possono essere invertite bollendo 9. Qui, questi due vantaggi sono utilizzati per identificare non solo gli IPP permanenti, ma anche transitori di membrana proteins 6.
In breve, un Strep-tag è fuso al C-terminale della proteina di membrana integrale esca. Cellule che esprimono la proteina esca membrane vengono incubate con formaldeide che legami incrociati preda proteine alla proteina esca membrana (Figura 1). Non sono necessarie modificazioni delle proteine preda. Successivamente, la frazione di membrana è disposta. Pertanto, proteine di membrana vengono solubilizzati mediante trattamento detergente e esca proteine sono co-purificati con le sue proteine preda utilizzando purificazione per affinità. Successivamente, il cross-link è invertita mediante ebollizione, e l'esca e le sue proteine preda co-eluiti sono separati mediante SDS-PAGE. Infine, le proteine preda possono essere identificati mediante analisi immunoblot o spettrometria di massa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analisi membrana colonna vertebrale è un approccio biochimico che permette di confermare e per identificare a questo punto sconosciuti partner di interazione di proteine di membrana. Membrana SPINE combina in vivo reticolazione da formaldeide con purificazione di una proteina di membrana esca Strep-tag. La combinazione con immunoblotting facilita la conferma di partner di interazione previsti (Figura 2). Inoltre, la combinazione con analisi MS consente l'identificazione di partner di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 di SH
Materials
| 37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
| Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
| n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
| 1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
| Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
| Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
| Ultracentrifuge |
Referências
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