Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana<em> En Vivo</em

Summary

Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.

Abstract

Las proteínas de membrana son esenciales para la viabilidad celular y son, por tanto, importantes objetivos terapéuticos ^1-3. Desde que funcionan en los complejos ^4, los métodos para identificar y caracterizar sus interacciones son necesarias ^5. Con este fin, hemos desarrollado el Strep-proteína de membrana experimento de interacción, denominada membrana-COLUMNA ^6. Esta técnica combina en vivo entrecruzamiento reversible mediante el formaldehído reticulante con la purificación por afinidad de una proteína de membrana de cebo-Strep etiquetado. Durante el procedimiento, las proteínas presa reticulados son co-purificadas con la proteína cebo membrana y posteriormente separados por ebullición. Por lo tanto, dos grandes tareas se pueden ejecutar en el análisis de las interacciones proteína-proteína (PPI) de las proteínas de membrana mediante membrana-COLUMNA: en primer lugar, la confirmación de un compañero de interacción propuesto por inmunotransferencia, y en segundo lugar, la identificación de nuevos socios de la interacción mediante el análisis de espectrometría de masas . Además, incluso lOW afinidad, IBP transitorios son detectables por esta técnica. Por último, la Membrana-ESPINA es adaptable a casi cualquier tipo de célula, por lo que es aplicable como herramienta de detección de gran alcance para identificar los IBP de proteínas de membrana.

Introduction

Para entender la función de una proteína que es esencial conocer sus compañeros de interacción. Varias técnicas clásicas están disponibles para la identificación de parejas de interacción de proteínas solubles. Sin embargo, estas técnicas no son fácilmente transferibles a proteínas de la membrana debido a su naturaleza hidrófoba ^4. Para superar esta limitación, hemos desarrollado la membrana Strep-proteína interacción experimento (Membrana-COLUMNA) ^6. Se basa en el método de columna vertebral, que era sólo es adecuado para proteínas solubles ^7.

Beneficios de membrana-espina dorsal de dos ventajas de la formaldehído agente de reticulación: primero, el formaldehído pueden penetrar fácilmente las membranas y por lo tanto genera una instantánea precisa de la interactoma de una célula viva ^8. En segundo lugar, formaldehído enlaces cruzados pueden revertirse mediante ebullición ^9. Aquí, estas dos ventajas se utilizan para identificar no sólo los IBP permanentes pero también transitorios de prot membranains ^6.

En breve, un Strep-etiqueta se fusiona al C-terminal de la proteína cebo integral de membrana. Las células que expresan la proteína cebo de membrana se incuban con formaldehído que los enlaces cruzados se aprovechan de las proteínas a la proteína cebo membrana (Figura 1). No son necesarias modificaciones de las proteínas de la presa. A continuación, la fracción de membrana se prepara. Por lo tanto, las proteínas de membrana se solubilizan por tratamiento con detergente y cebo proteínas son co-purificadas con sus proteínas presa utilizando la purificación por afinidad. Posteriormente, la reticulación se invierte por ebullición, y el cebo y sus proteínas presa co-eluidos se separan por SDS-PAGE. Finalmente, las proteínas presa pueden ser identificados por análisis de inmunotransferencia o espectrometría de masas.

Protocol

Nota: La información detallada sobre los buffers que fija el Protocolo se encuentra disponible en la Tabla 1. 1. La fijación de las interacciones proteína-proteína por formaldehído entrecruzamiento en células vivas Para comenzar a preparar los medios de crecimiento, las soluciones madre y tampón P1 Preparar medio 500 ml: El medio debe ofrecer condiciones que apoyan la interacción entre la proteína cebo membrana y las proteínas de la presa. Adem?…

Representative Results

Análisis COLUMNA membrana permite la co-purificación de proteínas de membrana y proteínas asociados transitoriamente interactúan. El co-purificación se logra mediante el uso de la formaldehído agente de reticulación. Dos parámetros son fundamentales para evitar inespecíficos enlaces cruzados: la concentración de formaldehído y el tiempo de reticulación. El uso suficiente, pero no excesiva de formaldehído puede ser fácilmente controlado por inmunotransferencia. Complejos de proteínas reticuladas-formaldeh…

Discussion

Análisis COLUMNA membrana es un enfoque bioquímico que permite a uno para confirmar e identificar a este punto desconocidos compañeros de interacción de proteínas de membrana. COLUMNA membrana combina in vivo reticulación por formaldehído con la purificación de una proteína cebo membrana-Strep etiquetado. La combinación con inmunotransferencia facilita la confirmación de parejas de interacción predichas (Figura 2). Además, la combinación con el análisis de MS permite la identific…

Materials

37% Formaldehyde	Roth	4979.1	Should not be older than one year
DNaseI	Sigma	DN25
BCA protein assay kit	Pierce	23225
Micromagnetic rod	Roth	0955.2	5 mm in length, 2 mm in diameter
Triton X-100	Roth	6683.1	standard detergent for solubilization
n-Dodecyl-β-maltoside	Glycon	D97002-C	the best detergent to solubilze CpxA
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column	IBA	2-1207-050
Strep-tag protein purification buffer set	IBA	2-1002-001	Contains buffer W and buffer E
Amicon Ultra-4 centrifugal filter	Millipore	UFC803024
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
SilverQuest Silverstaining kit	Invitrogen	LC6070
FireSilver Staining Kit	Proteome Factory	P-S-2001
Ultracentrifuge