A abordagem bioquímica é descrita a identificação in vivo de interacções proteína-proteína (PPI), de proteínas de membrana. O método combina a proteína de ligação cruzada, de purificação por afinidade e espectrometria de massa, e é adaptável para quase qualquer tipo de célula ou organismo. Com esta abordagem, embora a identificação de IPP transientes torna-se possível.
As proteínas da membrana são essenciais para a viabilidade celular e, portanto, são alvos terapêuticos importantes 1-3. Desde que funcionam nos complexos de 4, métodos para identificar e caracterizar as suas interacções são necessárias 5. Para isso, desenvolvemos a membrana Strep-proteína experimento interação, chamada de membrana-espinha 6. Esta técnica combina in vivo de ligação cruzada utilizando o formaldeído reversível de reticulação com a purificação por afinidade de uma proteína de membrana de isca Strep-tag. Durante o procedimento, as proteínas presa reticulados são co-purificados com a proteína de membrana de isca e, subsequentemente, separado por ebulição. Assim, duas grandes tarefas podem ser executadas quando se analisa as interações proteína-proteína (IBP) de proteínas de membrana usando Membrane-espinha: primeiro, a confirmação de um parceiro de interação proposto por immunoblotting e, segundo, a identificação de novos parceiros de interação através da análise de espectrometria de massa . Além disso, mesmo low afinidade PPIs transientes são detectáveis por esta técnica. Finalmente, Membrane-espinha é adaptável a praticamente qualquer tipo de célula, tornando-o aplicável como ferramenta de triagem para identificar poderoso PPIs de proteínas de membrana.
Para entender a função de uma proteína que é essencial conhecer os seus parceiros de interação. Várias técnicas clássicas estão disponíveis para a identificação de parceiros de interacção de proteínas solúveis. No entanto, estas técnicas não são facilmente transferíveis para a membrana proteínas, devido à sua natureza hidrofóbica 4. Para ultrapassar esta limitação, foi desenvolvido o Strep-proteína de membrana interacção experimento (Membrane-SPINE) 6. Ele baseia-se no método da coluna vertebral, que era apenas adequado para proteínas solúveis 7.
Benefícios membrana da coluna vertebral de duas vantagens do formaldeído agente de reticulação: primeiro, o formaldeído pode facilmente penetrar as membranas e, consequentemente, gera uma imagem precisa da interactoma de uma célula viva 8. Em segundo lugar, formaldeído ligações cruzadas pode ser revertida por ebulição 9. Aqui, estas duas vantagens são usados para identificar não só IPP permanentes, mas também transientes de prote membranains 6.
Em resumo, um Strep-tag está fundido com o terminal C da proteína de membrana integral isca. As células que expressam a proteína de membrana de isca são incubadas com formaldeído, que as ligações cruzadas atacam proteínas para a proteína isco membrana (Figura 1). Modificações de proteínas presas não são necessários. Em seguida, a fracção de membrana é preparado. Portanto, as proteínas da membrana são solubilizados por tratamento com detergente e isca proteínas são co-purificados com suas proteínas presas utilizando a purificação por afinidade. Subsequentemente, a ligação transversal é invertida por ebulição, e o isco e suas proteínas presa co-eluidas são separadas por SDS-PAGE. Finalmente, as proteínas de presa pode ser identificado por análise de imunotransferência ou espectrometria de massa.
Análise Membrane coluna vertebral é uma abordagem bioquímica que permite que se confirmar e identificar este ponto parceiros de interação desconhecidos de proteínas de membrana. Membrana COLUNA combina in vivo cross-linking por formaldeído com purificação de uma proteína de membrana isca Strep-marcado. A combinação com imunotransferência facilita a confirmação de parceiros de interacção previstas (Figura 2). Além disso, a combinação com análise MS permite a identificação …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada por doações da Deutsche Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 e SFB940 a SH
37% Formaldehyde | Roth | 4979.1 | Should not be older than one year |
DNaseI | Sigma | DN25 | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
Micromagnetic rod | Roth | 0955.2 | 5 mm in length, 2 mm in diameter |
Triton X-100 | Roth | 6683.1 | standard detergent for solubilization |
n-Dodecyl-β-maltoside | Glycon | D97002-C | the best detergent to solubilze CpxA |
1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column | IBA | 2-1207-050 | |
Strep-tag protein purification buffer set | IBA | 2-1002-001 | Contains buffer W and buffer E |
Amicon Ultra-4 centrifugal filter | Millipore | UFC803024 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
SilverQuest Silverstaining kit | Invitrogen | LC6070 | |
FireSilver Staining Kit | Proteome Factory | P-S-2001 | |
Ultracentrifuge |