Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Benaderingen voor het testen van de effecten van antipsychotica (APD) in Caenorhabditis elegans worden gedemonstreerd. Assays zijn beschreven voor het testen van geneesmiddelen effecten op de ontwikkeling en de levensvatbaarheid en keelholte pompsnelheid. Deze methoden zijn ook van toepassing voor farmacogenetisch experimenten met andere dan APD drugklassen.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie. APD blootstelling produceert ontwikkelingsvertraging en / of letaliteit bij nematoden in een concentratie-afhankelijke wijze. Deze fenotypes worden veroorzaakt, gedeeltelijk door APD-geïnduceerde remming van pharynx pompen 1,2. Aldus, de ontwikkeling fenotype een neuromusculaire basis, waardoor het nuttig farmacogenetische studies van neuroleptica. Hier laten we zien gedetailleerde procedures voor het testen van APD effecten op de nematode ontwikkeling en keelholte pompen. Voor de ontwikkelings-test worden gesynchroniseerd embryo's op nematode groeimedium (NGM) platen die APD, en de fasen van de ontwikkeling van ani geplaatstmals worden vervolgens dagelijks gescoord. Voor de keelholte pompsnelheid assay, geënsceneerd jonge volwassen dieren worden getest op NGM platen met APD. Het aantal keelholte pompen per tijdseenheid wordt opgenomen, en de pompsnelheid wordt berekend. Deze testen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van vele andere soorten kleine moleculen of zelfs grote moleculen.
Introduction
Caenorhabditis elegans is een eenvoudige genetische organisme vatbaar zijn voor grootschalige vooruit en achteruit genetische screens en chemische genetische screens. C. elegans is gevoelig voor een breed spectrum van bioactieve verbindingen en is derhalve met succes gebruikt om de werkingsmechanismen van een verscheidenheid van dergelijke verbindingen vast. Bijvoorbeeld, bioactieve verbindingen bestudeerd met behulp van worm farmacogenetica bevatten acetylcholine receptor agonisten (zoals levamisol, nicotine, morantel en pyrantel), anesthetica (bijv. halothaan), cafeïne, cholinesteraseremmers (bijv. aldicarb, Lannate en trichloorfon), fluoride, GABA-gerelateerde stoffen (bijv. GABA en muscimol), ivermectine, paraquat, forbolesters en serotonine verwante drugs (bijv. serotonine en imiprimine) 3. Bovendien C. elegans is gebruikt voor grootschalige klein molecuul schermen, waardoor ontdekking van nieuwe bioactieve verbindings en de identificatie van nieuwe genetische doelwitten 4.
De C. elegans genoom omvat potentiële antipsychotische geneesmiddel (APD) doelen geconserveerd bij de mens, waaronder genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn voor synthese van neurotransmitters en synaptische structuur en functie 5. Aldus C. elegans neurogenetica en neurobiologie aan de lezer methoden voor het ontdekken van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD. In nematoden, APD blootstelling vroeg in de ontwikkeling veroorzaakt vertraging in de ontwikkeling, en bij hogere concentraties, dodelijkheid 2,6. APD blootstelling tijdens de volwassenheid produceert gedragsproblemen fenotypes. Bijvoorbeeld, clozapine blootstelling remt motoriek en keelholte pompen en verbetert de eileg 1,2,7.
APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid zijn krachtige fenotypes voor grootschalige chemische genetische screens. Deze fenotypes complex voorzover zij waarschijnlijk meer dan een cellulaire en genetische basis. Daarom worden dergelijke genetische screens wordt naar verschillende indirecte targets opleveren. Echter, heeft ons laboratorium kandidaat-gen schermen en een genoom-brede RNAi scherm onderdrukkers van APD-geïnduceerde vertraging in de ontwikkeling en dodelijkheid uitgevoerd en heeft met succes hersteld genen die waarschijnlijk coderen directe doelen, waaronder dopamine, insuline, en nicotine acetylcholine receptoren 2,8. Genetische screens op basis van APD-geïnduceerde gedrag in de volwassen hebben ook geleid tot de identificatie van nieuwe doelwitten APD, en we zijn nu valideren van targets van zowel ontwikkelings-en gedragsproblemen schermen in zoogdieren 7. Zo verschijnt er een ongewervelde chemisch genetische benadering van nieuwe moleculaire werkingsmechanismen van APD ontdekken haalbaar 5,8 te zijn.
De C. elegans keelholte is een orgaan dat 20 neuronen, 20 spiercellen en 20 accessoire cellen, verpakt door een basaal membraan omvat. Net als de zoogdierhart, de keelholte autonoom eennd voortdurend pompen van voedsel in de externe omgeving 9. Remming van de keelholte pompsnelheid compromissen voedselopname, en dus mutaties of geneesmiddelen die de keelholte pompen oorzaak vertraging in de ontwikkeling te remmen of te stoppen 9. APD's remmen de keelholte pompsnelheid, goed voor een deel van hun effecten op de ontwikkeling en levensvatbaarheid 1,2. Hier gebruiken we de atypische APD clozapine als een voorbeeld voor drug testen voor nematode ontwikkeling en keelholte pompen demonstreren.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier werkwijzen voor het testen van de effecten van APD op de ontwikkeling en het gedrag van C. elegans. DMSO of ethanol wordt gebruikt clozapine lossen, omdat het geneesmiddel relatief onoplosbaar in water. Omdat oplosmiddelen gemeld beïnvloeden C. elegans biologie 12, DMSO-alleen of ethanol-alone controlegroepen essentieel. De hoogste concentratie van DMSO in onze testen is aan 3%, die geen duidelijk effect op C. heeft elegans ontwikkeling. DMSO kan worden…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd ondersteund door een NIH Clinical Scientist Development award K08NS002083, een Shervert Frazier Research Institute Grant, en een NARSAD Young Investigator Award aan Edgar A. Buttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. . C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
