Méthodes pour étudier les mécanismes d'action des antipsychotiques dans<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Approches pour tester les effets des médicaments antipsychotiques (APDS) dans Caenorhabditis elegans sont démontrés. Les dosages sont décrits pour tester les effets des médicaments sur le développement et sur la viabilité et le taux de pompage du pharynx. Ces méthodes sont également applicables pour les expériences pharmacogénétiques avec d'autres classes de médicaments que les PDA.
Abstract
Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle avant et arrière écrans génétiques et les écrans génétiques chimiques. Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l'homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique. Exposition APD produit retard et / ou la létalité chez les nématodes de développement d'une manière dépendante de la concentration. Ces phénotypes sont dus, en partie, par l'inhibition induite APD de 1,2 pharyngée pompage. Ainsi, le phénotype de développement a une base neuromusculaire, ce qui est utile pour des études pharmacogénétiques des neuroleptiques. Ici, nous démontrons des procédures détaillées pour tester les effets APD sur le développement des nématodes et du pharynx pompage. Pour le dosage du développement, les embryons sont placés synchronisés sur un milieu de croissance de nématodes (NGM) des plaques contenant APDs, et les stades de développement de l'anusmaux sont ensuite marqués quotidien. Pour le test de débit de pompage du pharynx, mis en scène de jeunes animaux adultes sont testés sur des plaques NGM contenant APD. Le nombre de pompes du pharynx par unité de temps est enregistré, et le débit de pompage est calculé. Ces dosages peuvent être utilisés pour l'étude de nombreux autres types de petites molécules ou même de grandes molécules.
Introduction
Caenorhabditis elegans est un organisme génétique simple prêtent à grande échelle écrans génétiques avant et arrière et des écrans génétiques chimiques. C. elegans est sensible à un large spectre de composés bioactifs et a donc été utilisée avec succès pour déterminer les mécanismes d'action de ces divers composés. Par exemple, les composés bioactifs étudiés en utilisant la pharmacogénétique à vis sans fin comprennent des agonistes des récepteurs de l'acétylcholine (par exemple, lévamisole, la nicotine, morantel, et pyrantel), anesthésiques (par exemple, l'halothane), la caféine, les inhibiteurs de cholinestérase (par exemple, l'aldicarbe, Lannate, et trichlorfon), le fluorure, le GABA-connexes composés (par exemple GABA et muscimol), l'ivermectine, le paraquat, les esters de phorbol et les médicaments liés à la sérotonine (par exemple, la sérotonine et imiprimine) 3. Par ailleurs, C. elegans a été utilisé pour les écrans de petites molécules à grande échelle, permettant la découverte d'un nouveau composé bioactifs et l'identification de cibles génétiques nouveaux 4.
Le C. génome elegans comprend médicament antipsychotique potentiel (APD) des cibles conservées chez l'homme, y compris les gènes codant pour des protéines nécessaires à la synthèse des neurotransmetteurs et pour la structure et la fonction synaptique 5. Ainsi, C. elegans neurogénétique et offre de neurobiologie méthodes pour découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d'action des APD. Dans les nématodes, exposition APD tôt dans le développement produit un retard de développement, et à des concentrations plus élevées, la létalité 2,6. Exposition APD à l'âge adulte produit phénotypes comportementaux. Par exemple, l'exposition clozapine inhibe la locomotion et du pharynx pompage et améliore la ponte 1,2,7.
Retard de développement APD-induite et la létalité sont des phénotypes puissants pour grands écrans génétiques chimiques. Ces phénotypes sont complexes dans la mesure où ils ont probablement plus d'un basi cellulaires et génétiquess. Par conséquent, ces écrans génétiques devraient donner une variété de cibles indirectes de drogue. Cependant, notre laboratoire a effectué des écrans de gènes candidats et un écran ARNi à grande échelle pour des suppresseurs de retard de développement APD-induite et de la létalité et les gènes qui codent probablement des cibles directes, y compris la dopamine, l'insuline et les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine 2,8 a réussi à récupérer. Cribles génétiques basés sur les comportements APD-induits chez l'adulte ont également conduit à l'identification de nouvelles cibles APD, et nous sommes maintenant la validation de cibles à partir des écrans à la fois développement et de comportement chez les mammifères 7. Ainsi, une approche génétique chimique invertébrés de découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires d'action des APD semble réalisable 5,8.
Le C. elegans pharynx est un organe qui comprend 20 neurones, 20 des cellules musculaires, et les 20 cellules accessoires, enveloppés par une membrane basale. Semblable à cœur de mammifère, le pharynx est un autonomend pompes constamment aliment depuis l'environnement externe 9. Inhibition de la vitesse de pompage du pharynx compromet l'absorption de nourriture, et donc des mutations ou des médicaments qui inhibent pharyngée pompage cause de retard de développement ou arrêter 9. APD inhibent le taux de pompage du pharynx, soit dans le cadre de leurs effets sur le développement et la viabilité 1,2. Ici, nous utilisons la clozapine APD atypique comme un exemple pour démontrer dosages de médicaments pour le développement des nématodes et du pharynx pompage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons les méthodes pour tester les effets des APD sur le développement et le comportement de C. elegans. DMSO ou de l'éthanol est utilisé pour dissoudre la clozapine, étant donné que le médicament est relativement insoluble dans l'eau. Parce que les solvants ont été signalés à affecter C. elegans biologie 12, le DMSO seul ou groupes de contrôle éthanol seul sont essentiels. La plus forte concentration de DMSO utilisés dans nos essais est jusqu'à 3%, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par une NIH prix scientifique de développement clinique K08NS002083, une subvention de l'Institut de recherche Shervert Frazier, et le Prix du jeune chercheur NARSAD à Edgar A. Buttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
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