Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Abordagens para testar os efeitos de drogas antipsicóticas (APDs) em Caenorhabditis elegans são demonstrados. Os ensaios estão descritos para testar efeitos de drogas sobre o desenvolvimento ea viabilidade e sobre a taxa de bombeamento da faringe. Estes métodos também são aplicáveis para as experiências de farmacogenética com outras classes de drogas que APD.
Abstract
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de grande escala para a frente e reverter telas genéticos e telas genéticos químicos. O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica. Exposição APD produz atraso e / ou letalidade em nemátodos desenvolvimento de uma forma dependente da concentração. Estes fenótipos são causados, em parte, pela inibição induzida por TPA de bombeamento da faringe 1,2. Assim, o fenótipo de desenvolvimento tem uma base neuromuscular, tornando-o útil para estes estudos de neurolépticos. Aqui demonstramos procedimentos detalhados para testar efeitos APD sobre o desenvolvimento do nematóide e da faringe de bombeamento. Para o ensaio de desenvolvimento, os embriões são sincronizados colocado em meio de crescimento de nemátodos placas (NGM) contendo APD, e as fases de desenvolvimento de animals são, então, marcou diária. Para o ensaio de taxa de bombeamento da faringe, encenado animais adultos jovens são testados em placas NGM contendo APDs. O número de bombas da faringe por unidade de tempo é gravado, ea taxa de bombeamento é calculado. Estes ensaios podem ser utilizados para estudar muitos outros tipos de moléculas pequenas ou até mesmo moléculas grandes.
Introduction
Caenorhabditis elegans é um organismo genético simples passíveis de telas genéticos frente e verso em grande escala e telas genéticos químicos. C. elegans é sensível a um amplo espectro de compostos bioactivos e, por conseguinte, tem sido usado com sucesso para definir os mecanismos de acção de uma variedade de tais compostos. Por exemplo, os compostos bioactivos estudada usando farmacogenética vermes incluem agonistas de receptor de acetilcolina (por exemplo, levamisole, nicotina, morantel, pirantel e), anestésicos (p.ex. halotano), cafeína, os inibidores da colinesterase (por exemplo, aldicarbe, Lannate, e TRICLORFOM), flúor, relacionadas-GABA compostos (por exemplo, GABA e muscimol), ivermectina, paraquat, ésteres de forbol e drogas relacionados com a serotonina (por exemplo, serotonina e imiprimine) 3. Além disso, C. elegans foi usado para telas de pequenas moléculas de grande escala, permitindo a descoberta de novos compostos bioactivoss e identificação de alvos genéticas novas 4.
O C. elegans genoma inclui potencial antipsicótico (APD) alvos conservados em seres humanos, incluindo genes que codificam proteínas necessárias para a síntese de neurotransmissores e para a estrutura e função sináptica 5. Assim, C. elegans neurogenetics e métodos oferta neurobiologia para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs. Em nematóides, exposição DPA no início do desenvolvimento produz atraso do desenvolvimento, e em concentrações mais elevadas, a letalidade 2,6. Exposição APD durante a idade adulta produz fenótipos comportamentais. Por exemplo, a exposição a clozapina inibe locomoção e bombeamento da faringe e aumenta a postura de ovos 1,2,7.
Atraso de desenvolvimento e letalidade induzida pela APD são fenótipos poderosas para telas genéticos químicos em larga escala. Estes fenótipos são complexa na medida em que eles provavelmente têm mais do que um basi celulares e genéticass. Portanto, tais telas genéticas são esperados para produzir uma variedade de alvos de drogas indirectos. No entanto, o nosso laboratório tem conduzido telas de genes candidatos e uma tela de RNAi de todo o genoma para supressores de atraso e a letalidade induzida por TPA de desenvolvimento e foi recuperado com sucesso genes que codificam provavelmente alvos directos, incluindo a dopamina, a insulina, e os receptores de acetilcolina nicotínicos 2,8. Telas genéticos baseados em comportamentos induzidos-APD no adulto também levaram à identificação de alvos APD novela, e agora estamos validando alvos das telas tanto de desenvolvimento e comportamentais em mamíferos 7. Assim, uma abordagem genética química invertebrados para descobrir os mecanismos moleculares de ação dos APDs parece ser viável 5,8.
O C. elegans faringe é um órgão que inclui 20 neurônios, células musculares, 20 e 20 células acessórias, envolto por uma membrana basal. Semelhante ao coração dos mamíferos, a faringe é um autónomaª constantemente bombas alimentos a partir do ambiente externo 9. A inibição da taxa de bombeamento da faringe comprometendo a absorção de alimentos e, portanto, mutações ou drogas que inibem bombeamento da faringe causa atraso no desenvolvimento ou prender 9. APDs inibir a taxa de bombeamento da faringe, o que representa, em parte, por seus efeitos sobre o desenvolvimento e viabilidade 1,2. Aqui, usamos a clozapina APD atípico como um exemplo para demonstrar testes de drogas para o desenvolvimento de nematóides e da faringe de bombeamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos métodos para testar os efeitos de APDs sobre o desenvolvimento e comportamento de C. elegans. DMSO ou o etanol é usado para dissolver a clozapina, uma vez que o fármaco é relativamente insolúvel em água. Porque os solventes foram relatados para afectar C. elegans biologia 12, grupos de controle de etanol-alone DMSO-alone ou são essenciais. A concentração mais elevada de DMSO utilizada nos ensaios é superior a 3%, o que não tem um efeito óbvio sobre C. elegan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi financiado pelo NIH um prêmio Desenvolvimento Scientist Clínica K08NS002083, um Grant Instituto de Pesquisa Shervert Frazier, e uma Investigator Award NARSAD Young para Edgar A. Buttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
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