Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em> Caenorhabditis Элеганс</em
Summary
Подходы к тестирования эффектов антипсихотических препаратов (APDS) в Caenorhabditis Элеганс демонстрируются. Анализы описаны для тестирования лекарственные эффекты на развитие и жизнеспособность и на скорости накачки глотки. Эти методы также применимы для экспериментов с фармакогенетических классов лекарственных средств, отличных от ЛФД.
Abstract
Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных вперед и назад генетические экраны и химические генетические экраны. С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции. Воздействие APD производит задержку и / или летальность в нематод с развитием в зависимости от концентрации. Эти фенотипы обусловлены, в частности, путем APD-индуцированного ингибирования глотки насосного 1,2. Таким образом, фенотип развития имеет нервно-мышечную основу, что делает его полезным для фармакогенетических исследований нейролептиков. Здесь мы показываем, подробные процедуры тестирования APD воздействие на развитие нематоды и глотки накачки. Для анализа развития, синхронизированные эмбрионы помещают на нематод роста среды (NGM) пластин, содержащие APDS, и этапах разработки Анинормалей затем забил в день. Для скорости накачки глотки анализа, устроили молодые взрослые животные были протестированы на NGM пластин, содержащих APDS. Количество глотки насосов в единицу времени записывается, и скорость накачки рассчитывается. Эти анализы могут быть использованы для изучения многие другие типы малых молекул или даже больших молекул.
Introduction
Caenorhabditis Элеганс простой генетический организм поддаются крупномасштабных прямой и обратной генетических экранов и химических генетических экранов. С. Элеганс чувствителен к широкому спектру биологически активных соединений, и поэтому успешно применяется для определения механизмов действия различных таких соединений. Например, биологически активных соединений изучены с помощью червя фармакогенетика включают агонисты рецептора ацетилхолина (например левамизол, никотина, морантел и Пирантела), анестетики (например, галотан), кофеин, ингибиторы холинэстеразы (например алдикарб, lannate и трихлорфон), фторид, ГАМК-связанных соединения (например ГАМК и мусцимол), ивермектин, паракват, форбол сложные эфиры и серотонина, связанных препараты (например, серотонина и imiprimine) 3. Кроме того, С. Элеганс был использован для крупномасштабных экранов небольшой молекулы, что позволяет открытие нового биологически активного соединенияс и выявление новых генетических мишеней 4.
С. Элеганс геном включает потенциальную антипсихотические препараты (APD) Цели консервативные у людей, в том числе генов, кодирующих белки, необходимые для синтеза нейромедиаторов и синаптической структуры и функции 5. Таким образом, С. Элеганс нейрогенетики и методы нейробиологии предложение для обнаружения новых молекулярных механизмов действия ЛФД. У нематод, экспозиция APD на ранних стадиях развития производит задержку развития и при более высоких концентрациях, летальность 2,6. Воздействие APD во взрослом возрасте вызывает поведенческие фенотипы. Например, клозапин воздействие подавляет передвижение и глотки накачку и повышает яйценоскость 1,2,7.
APD-индуцированной задержка развития и летальность являются мощными фенотипы для крупномасштабных химических генетических экранов. Эти фенотипы комплекс в той мере, они, вероятно, имеют более одного клеточные и генетические Basiс. Поэтому такие генетические экраны ожидается выход разнообразные косвенные лекарственных препаратов. Тем не менее, наша лаборатория провела генов-кандидатов экраны и экран RNAi генома для гасителей APD-индуцированной задержки развития и летальности и успешно восстановлены гены, которые, вероятно, кодируют прямые цели, в том числе дофамина, инсулин и никотиновых рецепторов ацетилхолина 2,8. Генетические экраны на основе APD-индуцированных поведения у взрослых, также привели к идентификации новых мишеней APD, и мы теперь проверки цели из обоих развития и поведения экранов у млекопитающих 7. Таким образом, беспозвоночных химические генетический подход, чтобы обнаружить новые молекулярные механизмы действия ЛФД представляется, возможно 5,8.
С. Элеганс глотки является органом, который включает в себя 20 нейронов, 20 мышечных клеток, и 20 вспомогательных клеток, завернутые базальной мембраной. Как и в сердца млекопитающих, глотки является автономнымй постоянно насосы еду в из внешней среды 9. Ингибирование скорости насосного глотки компромиссы поглощение пищи, и, таким образом мутации или препараты, которые подавляют глотки насосную причиной задержки развития или ареста 9. ЛФД ингибирования скорости глотки насосную, что составляет в части для их влияний на развитие и жизнеспособность 1,2. Здесь мы используем атипичной APD клозапин в качестве примера для демонстрации анализы наркотиков для развития нематод и глотки накачки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем методы тестирования эффектов ЛФД на развитие и поведение С. Элеганс. ДМСО или этаноле используют для растворения клозапин, так как препарат является относительно нерастворимым в воде. Поскольку растворители, как сообщается, повлияет C. Элеганс биологии 12…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана NIH Клинический награждения развития науки K08NS002083, грант Shervert Фрейзер научно-исследовательский институт, и NARSAD премия для молодых следователь к Эдгара А. Buttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
Referências
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. . C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
