Summary
Migração neuroblastos é um evento fundamental para a neurogênese pós-natal. Nós descrevemos um protocolo para a rotulagem eficiente de neuroblastos por eletroporação in vivo pós-natal e visualização posterior de sua migração utilizando time-lapse de imagens de fatias cerebrais agudas. Nós incluímos uma descrição para a análise quantitativa da dinâmica neuroblastos por rastreamento de vídeo.
Abstract
A zona subventricular (SVZ) é um dos principais nichos neurogénicos no cérebro pós-natal. Aqui, células progenitoras neurais proliferam e dão origem a neuroblastos, capazes de se mover ao longo do fluxo migratório rostral (RMS) em direcção ao bolbo olfactivo (OB). Esta migração de longa distância é necessário para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos no OB, mas os mecanismos moleculares que regulam este processo ainda não são claras. Investigando as vias de sinalização que controlam a motilidade neuroblasto não só pode ajudar a entender um passo fundamental para a neurogênese, mas também têm potencial regenerativo terapêutico, dada a capacidade desses neuroblastos atacar sites do cérebro afetadas por uma lesão, acidente vascular cerebral, ou degeneração.
Neste artigo descrevemos um protocolo detalhado para eletroporação in vivo pós-natal e posterior de imagens de lapso de tempo de migração neuroblastos na RMS do mouse. Eletroporação pós-parto pode eficientemente transfecção ZSV progenitorcélulas, que por sua vez geram neuroblastos que migram ao longo da RMS. Usando microscopia confocal girando time-lapse disco em culturas fatia agudas do cérebro, a migração neuroblastos pode ser monitorado em um ambiente que se assemelha de perto a condição in vivo. Além disso, a motilidade neuroblasto podem ser rastreados e analisados quantitativamente. Como exemplo, descrevemos como usar in vivo pós-natal eletroporação de um plasmídeo expressando GFP para rotular e visualizar neuroblastos que migram ao longo das RMS. Electroporação de shRNA ou plasmídeos que expressam CRE recombinase em ratinhos knockout condicionais que empregam o sistema LoxP também pode ser utilizado para alvejar genes de interesse. Manipulação farmacológica de culturas de fatias cerebrais agudas pode ser realizada para investigar o papel de diferentes moléculas de sinalização em migração neuroblastos. Ao unir em eletroporação vivo com imagens de lapso de tempo, esperamos compreender os mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblasto e contribuir para o desenvolvimentomento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.
Introduction
No cérebro de mamíferos, a geração de novos neurónios (neurogénese) ocorre após o nascimento, principalmente em duas regiões, da zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais e a zona subgranular no giro dentado do hipocampo 1. Evidências consideráveis se reuniram nos últimos anos suporta um papel crítico para a neurogênese pós-natal em funções de memória do hipocampo e bulbo olfatório 1-3. É importante ressaltar que a neurogênese pós-natal também tem potencial terapêutico por causa de sua relação com doenças neurológicas degenerativas, bem como a capacidade de neuroblastos para migrar para locais feridos no cérebro 4-6.
A zona subventricular (SVZ) surgiu recentemente como um nicho neurogênico crucial. Neuroblastos ZSV derivados migram para o bulbo olfatório (OB) através do fluxo migratório rostral (RMS), tornando este o processo de migração mais longa do 1,7,8 cérebro pós-natal. A / RMS / sistema OB mamíferos ZSV tornou-se ummodelo útil para estudar os diferentes passos de neurogênese, como proliferação, migração e diferenciação 1,8. Muitos fatores de crescimento e sinais extracelulares regulam a neurogênese ZSV e migração ao longo das RMS, mas os mecanismos moleculares intracelulares estão longe de ser totalmente compreendida 1,9. Migração adequada ao longo das RMS é crucial para a maturação posterior dos neurônios recém-nascidos 10. Além disso, alguns estudos têm mostrado que neuroblastos ZSV derivados podem migrar para fora da RMS para locais de lesão cerebral 4-6,11-13. Assim, investigar a migração neuroblastos mecanismos de sinalização de regulação é fundamental não só para entender a neurogênese, mas também para potenciais aplicações terapêuticas.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para rotular progenitores neurais SVZ por eletroporação in vivo pós-natal e acompanhar sua migração ao longo das RMS em culturas agudos fatia cérebro usando time-lapse confocal disco giratório microscopiapy. A electroporação é amplamente utilizado em estudos de desenvolvimento embrionário a partir de fases adultas 14-18. É uma ferramenta poderosa para direcionar e manipular progenitores neurais SVZ e representa uma alternativa mais barata e consideravelmente mais rápido a injeção estereotáxica de vetores virais ou geração de modelos transgênicos 1,15,19,20. É um procedimento relativamente simples que não precisa de cirurgia e tem altas taxas de sobrevivência. Eletroporação de shRNA ou CRE plasmídeos expressando recombinase em modelos genéticos de mouse que utilizam o sistema LoxP pode ser usado para alvejar genes de interesse ou para alcançar marcação permanente de progenitores SVZ, representando, portanto, uma ferramenta útil para os estudos de neurogênese adulta 21,22.
Imagem RMS neuroblasto migração no cérebro intacto ainda é um desafio devido a limitações técnicas atuais. No entanto, este processo pode ser monitorado usando disco confocal fiação microscopia de lapso de tempo de fatias cerebrais agudas, que proporcionam um sist adequadolos muito parecidas com a condição in vivo também passível de manipulação farmacológica 23,24. Acoplamento em electroporação pós-natal in vivo com imagiologia de lapso de tempo irá facilitar a compreensão dos mecanismos moleculares que controlam a motilidade neuroblastos e contribuir para o desenvolvimento de novas abordagens para promover a reparação do cérebro.
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Protocol
Este procedimento está de acordo com os Regulamentos do Reino Unido O Home Office (Lei procedimentos científicos animal, 1986). Os cientistas devem seguir as diretrizes estabelecidas e aprovadas pelos organismos reguladores animais institucionais e nacionais.
1. Pós-Natal Eletroporação
1.1. Preparação de capilares de vidro, solução de ADN e Electroporator
- Prepare capilares de vidro puxado (OD: 1,5 mm, ID: 0,86 mm) para injeção de DNA. (Configurações indicativos para um extrator capilar Sutter P-97 são: Heat 283; Puxe 50; Velocity 90; Tempo 50). Fazer uma marca no capilar que corresponde a um volume de cerca de 2 ul.
- Ajuste a tensão da electroporador para 5 pulsos quadrados, 50 ms / pulso a 100 V, com 850 intervalos ms (100 V, pulso em 50 ms, pulso OFF 850 ms, pulso 5).
- Dilui-se de elevada pureza (OD 260/280> 1.80) isenta de endotoxina plasmídeo de DNA para uma concentração final de 1-2 mg / mLcom endotoxina libertar tampão de Tris-EDTA, ou PBS. Recomenda-se adicionar 0,1% de Fast Green para a solução de ADN (o corante deve espalhar no ventrículo quando injectados com sucesso).
- Prepare os eletrodos 5-7 mm, o gel do eletrodo e aquecer a almofada de aquecimento.
1.2. Eletroporação
- Retirar um dia pós-natal do rato 2 filhote de gaiola e anestesiar lo por inalação de isoflurano (a um caudal de ~ 0,6 L / min).
- Após aproximadamente 1 min, determinar o estado de anestesia por meio da resposta pé pitada. Se ocorrer nenhum movimento, continue com injeção intraventricular.
- Carregar agulha capilar com 1-2 ul de ADN, utilizando um tubo de aspirador ligado ao capilar.
- Com uma fonte de luz fria, segure a cabeça do filhote entre o polegar eo dedo indicador de sua mão menos dominante. Ligeiramente puxar a pele para trás na cabeça para ajudar a identificação do ponto de injeção direita.
- Considere uma linha virtual entre o olho ea tele craniométricas marco lambda (Figura 1A). Inserir a agulha capilar em cerca de um terço do comprimento da linha de lambda (cerca de 1 mm a partir do ponto médio linha 15). Insira o capilar de cerca de 2 mm de profundidade, tornando-se de evitar a penetração profunda no cérebro.
- Injectar plasmídeo fundindo lentamente através da boca (uma seringa ligada ao capilar também pode ser utilizado). Durante este procedimento, certifique-se de que seus dedos não estão aplicando demasiada pressão sobre o cérebro, pois isso pode evitar injeção de sucesso plasmídeo.
- Pare injecção, quando uma quantidade mínima de solução de ADN é deixado no capilar. É aconselhável administrar com menos do que 1 ml para evitar o aumento pernicioso da pressão intracraniana.
- O revestimento de gel com os dois eléctrodos e colocá-las com o lado positivo sobre o lado lateral do hemisfério, onde o ADN foi injectada (Figura 1A). Por incorporação de DNA no ZSV rostral, colocar eletrodos levemente rostral aoponto de injeção. Variando posição do eletrodo pode alcançar especificidade regional de eletroporação em diferentes áreas do ZSV 22,25.
- Iniciar transferência atual, pressione o pedal de pulso pedal. Quando a eletroporação é completa, verifique a tensão no visor electroporador (valores de tensão não deve ser inferior a 90 V, uma vez que os valores mais baixos de tensão se correlacionam com baixa eficiência eletroporação).
- Reanimar o filhote sob oxigênio na almofada de aquecimento por alguns minutos e devolvê-lo à gaiola, colocando-o para longe da mãe. Certifique-se de que a mãe recupera o cachorro e se reúne com o resto da ninhada. Depois de eletroporação, deixe os filhotes com a mãe para 4-7 dias antes da próxima etapa.
2. Preparação das Culturas aguda do cérebro Fatia
2.1. Preparação de soluções e ferramentas
- As soluções que se seguem são necessárias (isto é também possível a utilização de DMEM-elevado teor de glicose para dissecar e imagiologia17):
Dissection Médio (500 ml)
Mídia equilibrada de Gey - 500ml
45% de Glicose - 5ml
Médio Filme (10 ml)
45% de Glicose - 0.110 ml
HEPES 1 M - 0,100 ml
Pen / Strep - 0,100 ml
FCS - 0.500 ml
B27 - 0,100 ml
Glutamina - 0.200 ml
Dulbecco Modified Eagle Medium (vermelho de fenol-livre) - 8,89 ml - Meio de aquecimento filme a 37 ° C.
- Coloque Millicell insere em um prato de cultura de fundo 35 milímetros de vidro contendo 1 ml de meio de filme e colocar num incubador humidificado a 37 ° C / 5% de CO 2.
- Prepare vibratome acessórios (chave de fenda, câmara, lâminas de barbear, cola).
- Prepare ferramentas de dissecação: tesouras, pequena espátula, pinça retas.
- Preparar as ferramentas para lidar com fatias: pincel pequeno ou loop inoculação suave (tamanho: 10 mL), pipetas Pasteur de plástico, uma caixa de gelo e vários pratos de plástico 6 cm.
- Pré-resfriar o meio de dissecçãoa 2-4 ° C.
2.2. Preparação de fatias do cérebro
- Encha um prato com seis centímetros médio dissecção resfriadas e colocá-lo em gelo (para manter fatias recém-cortadas).
- Após deslocamento cervical, use uma tesoura para decapitar o filhote do rato. Remover o couro cabeludo com um bisturi, cortar o crânio, ao longo da sutura sagital médio do OB para o cerebelo e remover suavemente as abas cranianos utilizando fórceps. Certifique-se de todo o cérebro é exposto e dissecar cuidadosamente-lo usando uma espátula, tendo especial cuidado para não danificar o tecido. A dissecção tem de ser feito com cuidado, mas ao mesmo tempo muito rapidamente (menos do que um minuto, se possível). Deslocação cervical é o nosso método preferido porque anestesia terminais com anestésicos drogas / gás pode influenciar as propriedades migratórias dos neuroblastos eo estado de saúde das culturas fatia do cérebro, que precisam ser trabalhada de forma relativamente rápida após o sacrifício de animais.
- Hemisect o cérebro com uma razou lâmina (Figura 2). Descarte hemisfério não injectado ou utilizar para outros experimentos.
- Coloque um pequeno pedaço de fita adesiva no porta-vibratome e usar a quantidade mínima necessária de cola para fixar o hemisfério cerebral em cima dela (Figura 2). Isso evita danos da superfície do suporte devido a repetidas aplicações de cola.
- Deixe a cola secar por alguns segundos.
- Coloque o suporte na bandeja do vibratome preenchido com solução dissecção pré-resfriado. O ponto do bolbo olfactivo em direcção da lâmina (Figura 2).
- Comece cortando o hemisfério cerebral usando as configurações apropriadas. Os parâmetros a seguir são recomendadas: espessura do corte 300 mm, a velocidade ~ 3-5; freqüência ~ 9. De alta freqüência e baixa velocidade são recomendados para evitar danos à fatia.
- Colete fatias usando um pincel pequeno ou um loop inoculação macio. Apenas manter fatias com OB visível (geralmente 2-3 fatias / cérebro). Tipicamente, a fatia contendo a maior parte dos ca RMSn ser encontrada em ~ 300 mm a partir da superfície de fundo.
- Verifique fatias sob um microscópio fluorescente padrão para o sinal GFP (certificando-se para lançá-los ao longo de verificar fluorescência em ambos os lados), e escolha os que apresentaram fluorescência ao longo da maioria dos RMS.
2.3. Cultivar fatias do cérebro do
- Em uma capa de cultura celular, cortar o terceiro mais caudal da fatia do cérebro e eliminar quaisquer vestígios de cola usando uma pinça reta finas ou um bisturi microdissection.
- Delicadamente aspirar a fatia usando uma pipeta Pasteur de plástico (corte a ponta da pipeta para criar uma abertura maior, isso vai evitar danos a fatia) e colocá-lo no centro de um pré-aquecido Millicell inserção.
- Certifique-se de lado, com o sinal fluorescente brilhante é colocado em contacto com o Millicell inserir (para imagens com um microscópio invertido).
- Remover o excesso de solução de dissecção no topo do inserto com uma pipeta.
- Deixe culturas fatia paraestabelecer-se a 37 ° C / 5% de CO2 durante pelo menos 1 hr antes de imagem.
3. Time-lapse de imagens de Migração neuroblasto
- Pelo menos 2 horas antes de imagem, ligue o sistema de Perkin Elmer UltraViewVoX disco confocal fiação, invertido Nikon Ti-E microscópio, Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2), arrefecido câmera CCD digital, e sistema de aquecimento (Solent Scientific), fixado em constante temperatura de 37 ° C.
- Abra o módulo de aquisição de software Volocity e clique no botão "Viz" e selecione o laser (s) para a imagem latente.
- Dentro de 2 horas de cérebro preparação fatia, coloque o prato fundo de vidro que contém a fatia do cérebro na câmara de imagem no palco microscópio.
- Utilize uma objectiva Nikon CFI Super Plano Fluor ELWD 20X/0.45 sob a luz fluorescente apropriado para selecionar e focar a área da fatia que vai ser trabalhada (por exemplo, a primeira parte descendente dos RMS logo após o local da injeção, ou o Elbow região das RMS, ou logo após o cotovelo antes neuroblastos entrar no OB).
- Configure a imagem time-lapse com as seguintes ações:
- No microscópio, clique no botão L100 para permitir a digitalização a laser da amostra.
- Em Volocity, abra o UltraView Laser Changer, selecionando o laser adequado (por exemplo, 488 nm laser para GFP).
- Ajustar o tempo de exposição (normalmente entre 100-500 ms) e a intensidade do laser (geralmente 20-30%) em função da intensidade do sinal fluorescente.
- Ajuste o ganho digital de imagem para melhorar a visualização celular.
- Selecione o intervalo de z-stack de imagem dentro da fatia do cérebro (geralmente ao longo de um intervalo de 100-120 mm). Escolha de um intervalo com um número adequado de células isoladas a fim de evitar possível sobrepor tanto quanto possível (isto irá facilitar a análise subsequente de rastreamento).
- Seleccione o espaçamento entre cada imagem z pilha (geralmente 2-4 mm) entre.
- Escolha o tempo intErval entre cada captura z pilha (por exemplo, 3 min) e a duração de imagem total (por exemplo três horas).
- Clique no ícone "salvar" para salvar as alterações nos parâmetros de imagem.
- Pressione o botão de gravação para iniciar a imagem.
- Imagiologia alternativo de amostras de controlo e experimentais (por exemplo, tratamento do veículo / fármaco ou diferentes plasmídeos electroporadas) ao longo do mesmo dia.
4. Analisando neuroblasto Migração
- No módulo Volocity quantificação, abra a biblioteca desejada criado depois de completar um experimento de time-lapse. Selecione "Focus prolongado" da caixa superior esquerdo (Figura 4A, passo 1).
- Clique na aba "Medidas" para exibir a janela de medição (Figura 4A, passo 2).
- Uma lista de tarefas é visível no canto inferior esquerdo da tela. Arraste "Track" (presente no âmbito do "Diversos" título na parte inferior daa lista) no espaço acima. Isto irá pedir a abertura de uma nova janela chamada "Track" no topo seção esquerda da tela (Figura 4A, etapa 3).
- Selecione "Pontos" na guia "Input" na janela Track (Figura 4A, passo 4).
- Clique na ferramenta Ponto (Figura 4A, passo 5).
- Começar a controlar a migração de neuroblastos, clicando com o mouse sobre a área central do corpo celular e manter o acompanhamento do movimento das células até o último instante do lapso de tempo é atingido (por exemplo ponto número 61 para um filme de longa hr-3) .
- Para obter os dados, escolha "Fazer item Medição" no menu Medidas (Figura 4B, os passos 6-7). Uma janela irá aparecer no centro da tela.
- Nesta janela, selecione "Um novo item de medição chamado:" e digite um nome (Figura 4C, passo 8). Lembre-se de selecionar a opção "Todos os pontos temporais" antes de pressing OK (Figura 4C, passo 9). Um arquivo de item de medição aparecerá sob o arquivo time-lapse e conterá os parâmetros de análise quantitativa (por exemplo, a distância de migração, velocidade, deslocamento, e de taxa de deslocamento).
- Dê um duplo clique no arquivo do item de medição para abri-la como uma janela (Figura 4D, passo 10).
- Para visualizar as faixas individuais de células analisadas, escolha "Ponto de rastos" entre as opções "Display" (Figura 4D, etapa 11).
- Botão direito do mouse sobre o arquivo do item Medição e exportá-lo como um arquivo de texto, que pode então ser importado em programas como o Excel para analisar parâmetros de migração.
- Para medir movimentos entre quadros consecutivos e pausas feitas por cada célula durante o período de filmagens, no arquivo do item de medição selecionar a opção "Exibir" opções "Ponto" ou "populações" e clique no ID (cada faixa tem uma identificação única). Exportar o arquivo resultante de procederção, tal como explicado no passo 4.10.
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Representative Results
Etiquetagem de neuroblastos migratórias SVZ derivados podem ser observadas ao longo da RMS, normalmente 4-8 dias depois de um bem sucedido electroporação (Figura 1B). Os pontos de tempo mais longos, também pode ser escolhido, mas menos células serão encontrados na RMS vez que a maioria terá entrado no OB. Os neuroblastos iniciar a aquisição de morfologia típica e características de células granulares maduros no OB de cerca de 2-3 semanas após a electroporação (não mostrado). Depois de cultura para ~ 1 hr, fatias de cérebro de filhotes eletroporados do mouse pode ser trabalhada de forma confiável por até 3-4 horas. Como relatado anteriormente 23,26, neuroblastos podem exibir dinâmica migração complexos (Figura 3 e Vídeo 1), que pode ser analisado quantitativamente usando tracking celular (Figura 4).
Figura 1. Postna Tal in vivo electroporação. (A) Desenho esquemático de eletroporação in vivo de um dia pós-natal 2 mouse filhote. Uma linha pontilhada (vermelho), que liga o olho ao craniometrical marco lambda serve como um marcador de posição para inserção capilar. O ponto de injeção é indicada como um ponto verde. Formas ovais cinzentas indicam a posição do eléctrodo, tal como descrito em Boutin et al. 15 (B) sagital fatia do prosencéfalo rato imunocoradas para a GFP de 5 dias após a electroporação de um plasmídeo que expressa GFP. Neuroblastos migram ZSV derivados são visíveis ao longo das RMS e alguns deles já começaram a chegar à OB. Ctx: córtex; ZSV: zona subventricular; RMS: fluxo migratório rostral; OB: bulbo olfatório. Bar, de 400 m. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 2. Passos esquemáticos na preparação de culturas fatia cerebral aguda para a imagem latente. (A) caudal e cortes intrahemispheric (linhas pontilhadas) são realizados num cérebro recentemente dissecados. (B) O hemisfério cerebral electroporação é colocado sobre um suporte de vibratome. (C) fatias sagitais são obtidos com um vibratome e observados sob um microscópio de fluorescência padrão (D). Fatias com o melhor sinal GFP são cultivadas por pelo menos 1 hora em um Millicell inserir dentro de um prato fundo de vidro, e (E), posteriormente, colocado em uma câmara ambiental para geração de imagens por um invertido confocal girando sistema de disco. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Figura 3. Time-lapse de imagens de migração neuroblastos. (A) disco giratório imagens time-lapse de neuroblastos tomadas a partir de uma fatia do cérebro do rato sagital 5 dias após a eletroporação de um expressando GFP plasmídeo. As imagens são de 1 hora de intervalo. Cada painel é uma projeção z-stack de 28 imagens consecutivas 4 mm de distância. As setas indicam 4 neuroblastos representativos migrando ao longo das RMS em direção ao bulbo olfatório (localizado fora da imagem no canto inferior direito). (B) caminhos migratórios representativa obtida em time-lapse imagem dos 4 neuroblastos em destaque na (A). (C) O gráfico mostra a distância migrada com o tempo por 2 neuroblastos representativos. Células exibir um comportamento típico móveis saltatory. Bar, 70 mM. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. Análise de rastreamento de migração neuroblastos. Etapas seqüenciais usadas para rastrear neuroblastos migram usando software Volocity. Por favor, veja o texto para uma descrição detalhada. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Vídeo 1:. Time-lapse de imagem de neuroblastos migram O filme mostra uma seção do RMS do mouse com neuroblastos migram marcado com GFP obtidos 5 dias após a eletroporação de um plasmídeo expressando GFP. O OB está localizado fora da vista para o canto inferior direito. Confocal z pilhas foram capturados sobre um disco giratório confocal com uma objectiva de 20X a cada 3 min durante 3 horas ao longo de um intervalo de 120 mM. Jogando Velocidade: 10 frames / seg.
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Discussion
Migração eficiente de progenitores neurais ao longo das RMS garante sua maturação posterior em neurônios funcionais 10. Fluxos importantes de progenitores neurais voltadas para o OB são visíveis na infância humana e são susceptíveis de desempenhar um papel importante no início de pós-natal o desenvolvimento do cérebro humano 27. Além disso, essas células são capazes de atingir locais do cérebro afetadas por lesões e neurodegeneração 4,28. Ser capaz de monitorar em tempo real o efeito de manipulação genética na dinâmica neuroblastos torna-se essencial para entender completamente como movimento neuroblasto é orientada e regulamentada.
Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar a migração neuroblastos ZSV derivados acoplando in vivo eletroporação pós-natal com lapso de tempo de microscopia confocal de disco giratório de culturas agudos fatia cérebro. Especificamente, nós mostramos como a migração de progenitores neurais pode ser rotulado por electroporating no ZSV um enc plasmídeooding GFP. Dependendo do objectivo do estudo, vários tipos de plasmídeos pode ser usado (por exemplo, permitindo a expressão de outras proteínas fluorescentes ou co-expressão do tipo selvagem / proteínas mutantes de interesse, CRE recombinase, ou shRNA juntamente com as proteínas fluorescentes). É altamente recomendável usar plasmídeos contendo o frango beta actina CAG promotor 29 para in vivo de expressão. Imagiologia de fatias cerebrais obtidos a partir de animais electroporação também pode ser utilizado para monitorar a migração radial das células progenitoras neurais no OB em pontos de tempo mais longos (7-10 dias) após a electroporação 30.
Depois de um período inicial de prática, in vivo pós-natal eletroporação torna-se um método muito confiável, permitindo rotulagem neuroblasto robusto tanto para imagens de lapso de tempo e análise de imunofluorescência. Além disso, esta técnica oferece uma vantagem fundamental em camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes sob promotores específicos de neuroblastos,onde a maioria dos neuroblastos são rotulados. De fato, eletroporação permite rotulagem esparsa de neuroblastos, permitindo assim uma análise detalhada de sua morfologia e dinâmica de migração. Em comparação com a entrega estereotáxica de vetores virais 31, esta técnica é mais barato, mais rápido e é muito bem tolerado por filhotes de rato. O principal inconveniente consiste no facto de que é limitada a fases pós-natais. Na verdade, é altamente recomendável utilizar dia pós-natal do rato 2 filhotes, uma vez que observamos uma diminuição substancial na eficiência de marcação, por vezes, mais tarde, quando os métodos de entrega virais se tornam mais adequado 31. No entanto, as estratégias como a electroporação de plasmídeos que expressam CRE em modelos genéticos de ratinho adequados pode ser utilizada para estudar a neurogénese em adulto fases 22.
Dois fótons, confocal standard, confocal disco giratório, e microscopia de fluorescência de campo amplo podem ser usados para visualizar neuroblasto migração 17,23,24. Spinning disco conmicroscopia focal é uma alternativa mais barata para a microscopia de dois fótons. Ele permite que imagens em 3D em velocidade superior através de múltiplos planos z, limitando fotodegradação em comparação com a microscopia confocal padrão e oferece uma resolução maior do que todo o campo de imagens de fluorescência 31-33. A maioria dos neuroblastos migram têm uma soma claramente visível e de um processo de liderança altamente dinâmico derrubado com um cone de crescimento.
Tal como descrito por outros 17, que tem uma câmara de perfusão que permitem avaliar directamente os efeitos de controlo e os tratamentos com drogas sobre a mesma fatia cerebral. Embora considere esta uma vantagem importante, o protocolo descrito aqui mostra que não é absolutamente necessário para a viabilidade celular para perfundir fatias com oxigenado artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) ou glicose alta DMEM 17,33. Além disso, usando um microscópio invertido permite a manipulação objetivo mais fácil em comparação com microscópios verticais equipadas com os objetivos de imersão em água.Nós descobrimos que o uso de um objectivo de longa distância 20X é um compromisso ideal, permitindo o rastreamento de um bom número de células (geralmente 25-40 por fatia) e produzir imagens de boa resolução (Video 1). Acompanhamento automático também é possível, no entanto, nem sempre é confiável. Por este motivo, recomendamos visual e, se necessário, a verificação manual dos dados de rastreamento automático. Superior imagiologia ampliação de neuroblastos individuais pode ser realizada utilizando uma objectiva Nikon Fluor DIC M/N2 40X/0.80W. O plugin ImageJ disponível gratuitamente MTrackJ também pode ser usado para medir as estatísticas básicas de pista 33, porém alguns arquivos de aquisição de dados brutos pode ser incompatível com este software e podem precisar ser convertidos em formatos adequados para análise, o que em certos casos pode ser demorado . A combinação de módulos de aquisição e análise de imagens fornecido pelo software Volocity permite uma transição imediata de captura de imagens / processamento para análise quantitativa de parâme migratóriotros (velocidade, deslocamento, etc), que podem ser facilmente visualizados em uma variedade de gráficos (por exemplo, que mostra padrões de migração / distância / direccionalidade / velocidade / persistência / tempo gasto imóvel, etc.)
Os neuroblastos exibir um movimento saltatório, alternando com fases estacionárias migratório 34,35 (Figura 3C). À luz do facto de que as fases estacionárias podem ter entre 4-10 min 32, acreditamos que a captura de imagens a cada 3 min representa um bom compromisso para seguir a migração neuroblastos com iluminação mínima e fotoenvelhecimento. Raramente vemos células parar por mais de 6 min, e descobrir que, ao longo de um período de 3 horas, eles geralmente passam uma média de 30 min imóvel. De acordo com relatórios anteriores, neuroblastos tem uma velocidade média de 60-100 mM / hr e um índice sinuoso média (deslocamento real sobre a distância migraram), ligeiramente acima de 0,6 23,36, o que está de acordo com nossas observações. Neossoloaliado, cerca de 60% das células apresentam um comportamento "migratório" (por exemplo, seguindo caminhos de migração quase lineares, com um índice sinuoso entre 0,6-1) e 20-25% são "exploratória" (com um índice sinuoso entre 0-0,4), enquanto os restantes cerca de 20% podem ser classificados como "intermediário" (alternando fases migratórias e exploratórias, com um índice sinuoso entre 0,4-0,6).
Nós reconhecemos que ainda existem limitações para esta técnica, uma vez que não pode filmar neuroblastos por mais de 3-4 horas sem observar alterações substanciais em sua motilidade. Filmar duração pode ser aumentada através da redução de freqüência de imagem (no entanto isso vai afetar a precisão da análise de migração), bem como pela adoção de uma câmara de perfusão de otimizar as condições ambientais para a geração de imagens. No entanto, o protocolo aqui descrito, incluindo um período de 3-4 horas de imagem representa um compromisso apropriado que permita a recolha de dados suficientes para a análise quantitativa demigração. De fato, até agora, conseguimos detectar os efeitos produzidos sobre a migração por superexpressão da proteína / regulação baixa 37 ou por manipulação farmacológica após comparação com os controles apropriados (, resultados inéditos Sonego e Zhou).
Em conclusão, a combinação de pós-natal in vivo eletroporação com imagem de disco giratório de culturas de fatias cerebrais representa uma poderosa ferramenta para monitorizar a dinâmica da migração de neuroblastos em um sistema que se assemelha de perto o ambiente in vivo, que oferece a possibilidade de se investigar em profundidade os mecanismos moleculares que controlam neuroblasto motilidade.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
MS e YZ são suportados pelo KCL e KCL-China bolseiros de doutoramento. MO foi financiado por uma Biotecnologia e PhD Ciências Biológicas Research Council studentship. Agradecemos Masaru Okabe e Jun-ichi Miyazaki para o plasmídeo PCX-EGFP e Alain Chedotal e Athena Ypsilanti para conselhos valiosos sobre eletroporação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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