Summary
دائرة التغذية في يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن يخدم نموذج بسيط لكنها قوية تسمح التغيرات في معدل التغذية لتكون مرتبطة مع بعض التعديلات في الدوائر العصبية فموي معدي. وتتألف هذه الدائرة من الخلايا العصبية هرمون السيروتونين المركزية التي ترسل التوقعات إلى السنانير الفم وكذلك المعى الأمامي.
Abstract
دائرة التغذية هرمون السيروتونين في يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن يمكن استخدامها لتحقيق ركائز العصبية ذات أهمية حاسمة خلال تطوير الدائرة. باستخدام الانتاج الفنية التابعة للدائرة، والتغذية، ويمكن تصور التغييرات في البنية العصبية للنظام فموي معدي. يمكن تسجيل سلوك التغذية من خلال مراقبة معدل التراجع من السنانير الفم، والتي تلقي تعصيب من الدماغ. يستخدم السلوك الحركي كوسيلة لمراقبة الفسيولوجية للتغذية، منذ اليرقات استخدام خطاطيف أفواههم لاجتياز عبر الركيزة أجار. يمكن ربط التغيرات في سلوك التغذية مع بنية محور عصبي من neurites التي التعصيب القناة الهضمية. باستخدام المناعية فمن الممكن تصور وquantitate هذه التغييرات. سوء التعامل من اليرقات خلال نماذج السلوك يمكن أن يغير البيانات لأنها حساسة جدا للتلاعب. التصوير السليم للالتعصيب العمارة محوارالأمعاء هو أمر حاسم لتحديد الكميات دقيقة من رقم وحجم دوالي وكذلك مدى العقد الفرع. تحليل معظم الدوائر تسمح فقط لرؤية العمارة محوار أو الآثار السلوكية، ولكن هذا النموذج يسمح احد لربط الانتاج الفنية التابعة للدائرة مع ضعف في بنية الخلايا العصبية.
Introduction
ذبابة الفاكهة هو نظام نموذجي قوية للغاية لدراسة تطوير الدوائر العصبية بسبب الوقت جيل السريع والتكلفة المنخفضة التجريبية، والقدرة على التعامل والتحكم في العوامل الوراثية والبيئية. يتم حفظها تكوين الخلايا العصبية، وتقصي مسار الخلايا العصبية وsynaptogenesis بين البشر وذبابة الفاكهة، وبالتالي يتم حفظها الآليات في إنشاء وصيانة وتعديل الدوائر العصبية أيضا.
يمكن الناقلات العصبية الكلاسيكية، مثل السيروتونين (5 هيدروكسي، أو 5-HT) بمثابة عوامل النمو قبل اعتماد أدوارهم كما يشير الجزيئات في الدائرة العصبية الناضجة 1-3 وقد أظهرت دراسات سابقة أن المستويات منزعجة من 5-HT خلال مرحلة التطور الجنيني تغيير التواصل بين الخلايا العصبية الناضجة 4. وقد أظهرت آخرون أن تطبيق خارج الرحم من 5-HT إلى الخلايا العصبية مثقف Helisoma قمع ثمرة neurite وكذلك synaptogenesis 5-7. في Drosophila والتنموية مستويات 5-HT ترتبط عكسيا مع عدد دوالي والحجم، وكذلك درجة aborization، على طول neurites التي توقع على المعى الأمامي من الجهاز العصبي المركزي 8.
وقد تبين العصبي السيروتونين لتعديل السلوكيات التغذية في الأنواع المختلفة، بما في ذلك ذبابة الفاكهة 8-9. دائرة التغذية في ذبابة الفاكهة هو دائرة بسيطة نسبيا والتي يمكن استخدامها كنموذج لربط المخرجات الوظيفية (التغذية) مع بعض التعديلات في تطوير التوقعات محور عصبي من الدماغ إلى المعى الأمامي. Schoofs وآخرون. وقد أظهرت أن التغذية اليرقات ذبابة الفاكهة والتي تنظمها مولدات نمط المركزية التي تؤثر على الجهاز العضلي 10. في حين أن التشريح العضلي محددة ليست مفهومة تماما، فقد تبين أن العصب antennal، العصب الفكي، والعصبية التبعي prothoracic هي المسؤولة عن أهداف العضلات المشاركة فيتغذية السلوك. معظم البيانات التي تنطوي على العضلات والأعصاب وعلم التشريح التغذية اللافقارية يقتصر على خوتع اليرقات.
يمكن تقييم معدل تغذية يرقات العمر الثاني من قبل التراجع من sclerites cephalopharyngeal (الفم السنانير)، واستنساخه وعالية الإنتاجية. ومعصب لوحات cephalopharyngeal بواسطة ألياف من الخلايا العصبية المركزية 5-HT عبر العصب الجبهي. على مقدم المعدة أو المعى الأمامي، ومعصب ألياف هرمون السيروتونين (الراجع العصبية) التي fasciculate في المعي المتوسط، ومسؤولة عن تقلصات في المعى الأمامي (الشكل 1) 11-12. التغييرات في المتفرعة محور عصبي، وعدد وحجم دوالي على طول محوار، يمكن quantitated باستخدام تقنيات المناعى. يمكن التلاعب العصبية 5-HT خلال التنمية، سواء بشكل مباشر أو غير مباشر، تغيير الانتاج وظيفية من هذه الدائرة التغذية، والتي يمكن تقييمها وترتبط مع التغيرات في morpholoغراي من العمارة محوار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. صيانة أقفاص السكان
- الحفاظ على أقفاص السكان عند 25 درجة مئوية على دورة ضوء الظلام 12 ساعة. طالما تتعرض مجموعات المراقبة والتجريبية لظروف الإضاءة نفسه، ثم هذا الأسلوب لا يمكن أن يؤديها في إعداد مختبر القياسية.
- تسمح الإناث لوضع البيض بين عشية وضحاها على التفاح عصير لوحات أجار.
- جمع اليرقات حديثة الفقس من خلال الحفاظ على لوحات مع البيض المودعة حديثا في 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وضع الكمشه صغيرة من الخميرة في وسط لوحة لجذب اليرقات.
- 1 شارع الطور جمع اليرقات التي هاجرت إلى عجينة الخميرة في وسط لوحة عصير التفاح. استخدام ملعقة معدنية لتحويلها إلى لوحة عصير التفاح الطازج. ويمكن أن يضاف معجون الخميرة إضافية لضمان وجود الغذاء الكافي حتى يتم تنفيذ المقايسات. ويمكن أيضا لوحات عصير العنب أن تستخدم بدلا من لوحات عصير التفاح.
- الحصول الراحل الثانية 2 في وقت مبكر طور مرحلي الثالثة 3 لترarvae من خلال السماح 1 شارع الطور للسن 40-48 ساعة. ضمن هذا النطاق معدلات التغذية ثابتة 13. ويمكن التأكد عن طريق الفحص من سن السنانير الفم كما أن هناك تغييرات واضحة في هذا الهيكل مع كل تساقط اليرقات.
- يتم جمع الراحل الثانية 2 في وقت مبكر 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة لفحوصات السلوك حسب بلطف وعلى نطاق واسع غسل لوحات عصير التفاح مع الماء وجمع اليرقات على تصفية شبكة. ثم يتم نقل اليرقات إلى لوحة آغار.
- يتم تنفيذ كافة التحليلات بالتوازي باستخدام السيطرة وحيوانات التجارب.
2. بارادايم السلوكية - تحرك
- وضع واحد 3 يرقة طور مرحلي الثالثة على 2٪ أجار الركيزة في 100 ملم الأنسجة طبق الثقافة وتسمح لليرقة حتى يتأقلم لمدة 30 ثانية. اليرقات استخدام sclerites cephalopharyngeal بهم (الفم السنانير) لدفع أجسادهم عبر سطح الركيزة أجار. يتم ذلك على لوحة منفصلة لأننير هو أكثر صعوبة لتصور تقلصات الجسم في حل الخميرة كما الحيوان هو تقريبا نفس لون الخميرة.
- مراقبة وتسجيل كل حركة الأمامي الخلفي لأكثر من الركيزة لمدة 1 دقيقة. ن = 20 لكل الوراثي. يجب أن يعاير لا يزيد عن 10 لوحة في الحيوانات.
3. سلوك النموذج - تغذية
- باستخدام حادة اينوكس # 5 ملاقط، ونقل بعناية 3 يرقة طور مرحلي الثالثة من لوحة الحركي أجار إلى مركز لوحة أجار شغل مضافين مع 5 مل من محلول الخميرة 2٪ الخباز تفعيلها لل. تأكد من أن الحل هو متجانسة مثل الخميرة سوف يستقر مع مرور الوقت. عندما تكون في حل الخميرة، وسوف تظل اليرقات إلى حد كبير في المكان والأعلاف، وتسهيل مراقبة السلوك. معدل الفم تقلصات هوك يرتبط بشكل مباشر مع كمية من المواد الغذائية بلعها 14.
- تسمح اليرقة حتى يتأقلم لمدة 30 ثانية.
- مراقبة وتسجيل عددالفم تقلصات هوك لمدة 1 دقيقة. ن = 20 لكل الوراثي.
4. التشريح غوت اليرقات
- جعل 4٪ EM-الصف حل الفورمالديهايد التثبيت في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) ووضعه في كوب بقعة 3 جيدا.
- تشريح بعناية يتجول في وقت متأخر 3 طور مرحلي الثالثة الشجاعة اليرقات في طبق زجاج 3 جيدا باستخدام الحل برنامج تلفزيوني 1X، والتأكد في كل مرة أن يتم ترك مقدم المعدة سليمة. مع forcep واحدة، وعقد نهاية الخلفي، ومع الآخر، مع الاستمرار على السنانير الفم. في حين عقد ثابت نهاية الخلفي، وسحب بلطف على السنانير الفم للوصول إلى الشجاعة. إزالة أي أنسجة المرتبطة (الغدد اللعابية والدماغ والجسم من الدهون، الخ)، ثم نقل كل الأمعاء إلى الطبق 3 جيدا يحتوي على الفورمالديهايد الإصلاح. يتجول 3 الثالثة طور مرحلي اليرقات تستخدم لأنه في هذه المرحلة من التنمية، ووقف تغذية اليرقة تمهيدا لpupariation، ويتم مسح مقدم المعدة من الخميرة. <لى> احتضان الشجاعة في 4 درجات مئوية خلال الليل في مربع مبهمة زراعة الأنسجة.
- قبل إزالة الحل الفورمالديهايد التثبيت من الآبار، وإزالة الجبل في المعدة والمعي المتوسط كليب ~ 150 ميكرون 2 من مقدم المعدة بحيث يمكن بوضوح أن ينظر التوقعات دون عائق.
- إزالة الإصلاح الفورمالديهايد من الآبار واستبدال PBT 1X (1X PBS، 0.1٪ خالية من ألبومين المصل البروتيني الأبقار، 0.1٪ تريتون X-100) حل العازلة. اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في 10 -6 M 5-HT لتعزيز السيروتونين الإشارة. اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن هذا تركيز الخارجية 5-HT لا يؤثر العمارة العصبية أو الكثافة دوالي في التحليلات المناعى وببساطة يعزز إشارة إلى نسبة الضوضاء 15-16.
- احتضان عند 4 و# 176؛ مئوية خلال الليل في الأجسام المضادة الأولية مكافحة السيروتونين (وحيدة النسيلة التي أثيرت في الماوس أو بولكلونل أثيرت في الأرنب). اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
- احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في الضد الثانوية (اليكسا فلور 568 الماعز المضادة للماوس أو المضادة للأرنب مفتش؛ 1:400 تمييع). اغسل الشجاعة 6X لمدة 10 دقيقة في PBT 1X. وضع عينات الأنسجة على محور دوار الميكانيكية أثناء القيام يغسل.
- احتضان في 4 ملي كربونات الصوديوم لمدة 10 دقيقة على محور دوار الميكانيكية، ثم جبل في 4٪ ن ن gallate/20 ملي كربونات الصوديوم، وعرض تحت مضان. ويستخدم كربونات الصوديوم لتحويل العينات إلى المخزن المؤقت ودرجة الحموضة المستخدمة في وسائل الإعلام مرس.
- التقاط الصور من عينات الأنسجة immunostained في التكبير 400X لتحليلها.
5. تحليل الدارات العصبية
- وتم قياس كمية الألياف محوار (عدد وحجم دواليودرجة التفرع) باستخدام Neuroleucida وNeuroexplorer. ومع ذلك، وهذا يمكن أيضا أن يتحقق يدويا أو باستخدام بسيطة محوار الراسم (تطبيق الحرة التي يمكن تحميلها عبر الإنترنت).
- تتبع التوقعات الألياف الفردية من الدماغ إلى مقدم المعدة وتحديد عدد دوالي والفروع وعدد من دوالي كبيرة لكل وحدة طول. هي واحدة من الألياف محور عصبي إسقاط من المخ إلى الأعصاب والراجع لا يمكن الوصول إليها لتحليلها حتى تصل إلى مقدم المعدة حيث فصل وfasciculate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
دائرة التغذية هرمون السيروتونين في يرقة ذبابة الفاكهة يمكن أن تكون بمثابة نموذج فعال للغاية لمراقبة تأثير العوامل بشكل خاص على تطوير النظام العصبي. بواسطة quantitating معدل التغذية، فمن الممكن لربط العمارة محور عصبي من الدائرة التغذية مع الانتاج الفنية للمجلس (الشكل 1). يستخدم الفحص الحركي كوسيلة لمراقبة الفسيولوجية للالتراجع عنها من السنانير الفم، لأن يرقات استخدام خطاطيف أفواههم لدفع أنفسهم عبر السطح من أجار. ينبغي أن يكون هناك أي اختلاف في الردود الحركي بين السيطرة والمورثات الطافرة إذا كانت الطفرات تؤثر فقط على دائرة التغذية 8 (الشكل 2A). إذا فروق ذات دلالة إحصائية القيام تحدث، فمن الممكن تعرض للخطر سلوك اليرقات التي كتبها سوء التعامل. إذا توقف اليرقات خلال الفحص في محاولة لتحفر من خلال الركيزة أجار، فإنها قد تكون قديمة جدا، ويرجح الانتقال إلى الطور تجول.فمن الممكن أيضا قد تكون الركيزة أجار من الصعب جدا، مما يجعل من الصعب على اليرقات السنانير الفم للاستيلاء على الركيزة أجار، وهذا يمكن أن تعالج عن طريق تبليل سطح أجار.
هذا الاختبار يمكن استخدامها لتقييم ما إذا كانت سلالات ذبابة الفاكهة مع العيوب التشريحية العصبية تؤثر على التنمية من دائرة التغذية هرمون السيروتونين. الجسم الإهليلجي متحولة المفتوحة (ايبو 3) لديه الخلل الهيكلي في الجسم الإهليلجي للمجمع المركزية. مقارنة مع البرية من نوع السلالة الأبوية كانتون-S، CS وو، يكشف عن أن هذه العيوب التشريحية خلال نتيجة نمو المخ في التغذية الاكتئاب بينما تنقل تتأثر (الشكل 2B).
العيوب التشريحية في ايبو تظهر 3 المسوخ لتغيير وتطوير البنية محوار للامعاء. الشكل 3 يبين التغيرات في بنية الألياف في اليرقات المقارنة ايبو 3أحمر مع CS وو، وهذه اليرقات عرض زيادة في المتفرعة وكذلك زيادة في عدد كل من دوالي الصغيرة والكبيرة على طول محوار. ملاحظة يمثل العقد فرع (الأسهم)، دوالي (السهام)، ودوالي كبيرة (النجمة). الشكل 4 الكميات من هذه الصور.
الكميات المناسبة من بنية محور عصبي يتطلب أن الصور تكون واضحة للغاية. يمثل الشكل 5A صورة مناسبة للتحليل. وسوف صور أقل جودة تجعل من الصعب التمييز بين الألياف ودوالي (الشكل 5B). عند تصوير العمارة الألياف، وتجنب أخذ الصور التي تشمل التوقعات في الجزء الأمامي من مقدم المعدة، لأن الألياف هي واحدة بإحكام ويتم فصل من بعضها البعض ويمكن أن تظهر كما لو أنها تشعبت و. وأكثر تشعبت أكثر ألياف الخلفي داخل المعي المتوسط لأنها fasciculate مرة واحدة لديهم إعادة في داخل هذا النسيج. الكميات من الفروع وعدد دوالي، وحجم دوالي، يمكن تحليلها يدويا أو عن طريق برنامج مصمم لغرض دراسة مورفولوجيا محوار، مثل Neuroleucida. طالما لا تلف مقدم المعدة خلال بروتوكول المناعى، والصورة هو في التركيز، فإن الاستعدادات تكون مقبولة للتصوير والتحليل. فإذا كانت بنية الألياف بشكل واضح يمكن تمييزها عن الخلفية، وإذا كان من الممكن تحديد دوالي الفردية على طول محوار، وإعداد مناسب للتحليل. أيضا، إذا يمكن تحديد دوالي الفردية عن بقية الألياف، وهذا هو أيضا مؤشر آخر على جودة الصورة للتحليل. ويتم تحليل جميع الألياف باستثناء تلك التي خارج نطاق التركيز (في بعض الحالات الألياف سوف منحنى بين الطائرات متعددة من التركيز).
es/ftp_upload/51062/51062fig1.jpg "العرض =" 500px "/>
الشكل 1. دائرة التغذية اليرقات. فيليه من 3 يرقة طور مرحلي الثالثة تبين أنسجة المخ والقناة الهضمية (A). و immunostained أنسجة القناة الهضمية من تشريح 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة مع الأجسام المضادة التي أثيرت ضد ذبابة الفاكهة هيدروكسيلاز التربتوفان العصبية (DTRH، B) أو 5-HT ( C). A، B. E والمريء؛ متولى حسن والفم السنانير؛ العلاقات العامة، ومقدم المعدة؛ برازيلي والدماغ (لاحظ نمط من الخلايا العصبية 5-HT). رأس السهم يعين العصب الجبهي؛ سهم، العصب الراجع C. مقدم المعدة تظهر الألياف محور عصبي (السهام). مقياس بار = 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
<ر /> الشكل 2. العيوب التشريحية خلال النتائج نمو الدماغ في سلوك التغذية الاكتئاب. ويعاير الحيوانات لالحركي (A) والسلوكيات التغذية (B). وكان تحرك تتأثر. ن = 20 لكل فحص السلوكية، 2-3 تجارب مستقلة. **** ع <0.0001، المفردة اختبار t. خطوط فوق الرسم البياني تصور الخطأ المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 3. العيوب التشريحية خلال تطوير نتائج CNS في انحراف في العمارة الألياف الأمعاء. الأنسجة تشريح الأمعاء من 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات وimmunostained مع anti-5-HT. السهم يدل على عقدة الفرع. رأس السهم يدل على دوالي الصغيرة. النجمة ديتلاحظ دوالي كبيرة. مقياس بار = 40 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 4. العيوب التشريحية خلال نتيجة نمو الدماغ الشاذة في العمارة الألياف الأمعاء. تحليل الأنسجة proventricular من 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة تشريح وحضنت مع مكافحة-5-HT. محوار المتفرعة (A)، وعدد من الكل دوالي في 0.1 ملم طول محوار (B) وعدد من دوالي كبيرة (> 1μm 2) لكل 0.1 ملم طول (C). CS وو، 20 ألياف من 17 الشجاعة من 2 تجارب مستقلة؛ ايبو 3، 20 ألياف من 18 الشجاعة من 3 تجارب مستقلة. **** ع <0.0001، ** ع <0.01، * ع <0.05، TT المفردةخطوط الرسم البياني أعلاه طبقا لتقديرات عام تصور الخطأ المعياري للمتوسط. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 5. جودة الصور مهم لتحديد الكميات المناسبة من بنية الألياف الأمعاء. أنسجة الأمعاء تشريح من CS وو 3 طور مرحلي اليرقات وimmunostained مع anti-5-HT. (A). صورة ذات نوعية جيدة. (B). ضعيف جودة الصورة. مقياس بار = 40 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التنمية الشاذة من الدائرة فموي معدي هرمون السيروتونين، والذي يحدث خلال مرحلة التطور الجنيني في وقت متأخر، وسوف يؤثر على وظيفتها ناضجة. التغييرات في بنية محوار التعصيب يمكن ربط الأمعاء مع الإخراج الفنية التابعة للدائرة، وهي إطعام معدل (تقاس عن طريق الفم تقلصات هوك في محلول الخميرة) (الشكل 1). استخدام النظام الثنائي UAS-GAL4 في ذبابة الفاكهة يجعل من الممكن خصيصا لاستهداف أعلى أو أسفل التنظيم تعبيرا عن نص معين إلى الأنسجة محددة، والتغيرات في التعبير عن بروتين معين يمكن quantitated على وجه التحديد نظرا للأدوات المناسبة. هذه التقنية يمكن استخدامها لتوضيح مناطق الدماغ، وحتى مجموعات فرعية العصبية اللازمة لتطوير الدوائر العصبية محددة.
يستخدم الفحص الحركي للتأكد من أن اليرقات لا خلاف للخطر من الناحية الفسيولوجية، وبالتالي، اليرقات مع تقلصات جدار الجسم 40 أو أقل شويونيتبول أن تستبعد من التحليلات (الشكل 2A). قد يحدث هذا إما بسبب وراثى يسبب تشوهات جسدية، أو لأن الحيوانات الفردية قد أصيبوا أثناء المناولة. بالإضافة إلى ذلك، درجة حرارة الغرفة التي يتم تنفيذ الفحص يحتاج إلى رقابة، منذ انخفاض درجات الحرارة أكثر دفئا أو يمكن أن تؤثر على البيانات. فمن المستحسن لإجراء هذا الاختبار السلوك بين 24-26 درجة مئوية. في أيام عندما تكون درجة الحرارة من غرفة الاختبار هو برودة، أجار لديه ميل لتتصلب، وبالتالي، سوف تكون هناك حاجة rewetting من لوحة آغار بعد اكتمال كل مقايسة قاطرة لضمان أجار لينة بما فيه الكفاية. فمن المهم للحفاظ على لوحة أجار لرطبة تنقل (وليس الرطب) من أجل السماح لليرقات أن يسافر عبر السطح ومنعهم من تختبئ. انخفاض درجات الحرارة أيضا تؤثر على أداء اليرقات على الركيزة أجار، كما اليرقات تميل إلى السفر نحو درجات الحرارة التفضيلية (24-26 درجة مئوية) 17-18. Nس يجب أن يعاير أكثر من 10 حيوانات في لوحة، وتجاهل أي لوحة مع ثقوب في الركيزة أجار.
عند تنفيذ فحص التغذية، من المهم أن ندرك أن تعليق الخميرة سوف يستقر مع مرور الوقت، الإلتفاف من الخميرة على لوحة يضمن الخميرة يبقى متجانسة في جميع أنحاء الفحص. يمكن أن يحدث انخفاض مدى الرؤية من السنانير الفم إذا كان هذا الحل الخميرة تصبح مركزة جدا. اليرقات صحية وضعت في العقد وسائل الإعلام الخميرة السنانير أفواههم حوالي 150-170 مرة في الدقيقة، وخفض التغذية يمكن أن تكون منخفضة مثل 120، والحد النطاق العلوي هو 210.
عند تنفيذ بروتوكول المناعى، فمن الحكمة أن immunostain كل من السيطرة وعينات الأنسجة التجريبية بالتوازي لضمان نوعية مماثلة لعينات الأنسجة. ويمكن تعزيز المناعي للبنية التعصيب محوار القناة الهضمية التي يحتضنها عينات الأنسجة في الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. س الحضانةو الأجسام المضادة في 4 درجات مئوية يحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء (الشكل 5). جودة الصور مهم جدا، لأن هذا أمر بالغ الأهمية لتحديد الكميات الدقيقة لبنية الألياف (الشكل 3) للكشف عن تغيرات في المتفرعة وعدد دوالي وحجم (الشكل 4). جودة عينات الأنسجة يمكن تدميرها إذا كان المدورة المستخدمة أثناء فترات الغسيل مع ارتفاع درجات الحرارة في أي نقطة من الاستعمال المستمر. بينما تصوير عينات الأنسجة تأكد من عدم ترك العينات تحت ضوء المجهر لفترة طويلة جدا حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل المناعي من العينات، وليس فقط واحد في إطار التركيز حاليا ولكن العينات المحيطة أيضا. تحليل بنية الألياف يمكن أن تكتمل بسهولة مع مساعدة من البرمجيات، ولكن لا يزال يمكن أيضا أن يتحقق يدويا. تصنيف دوالي الصغيرة والكبيرة تشير إلى منطقة دوالي، دوالي قياس أكبر من 1 ميكرون 2 تصنف على أنها دوالي كبيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أنوه صندوق أبحاث الرئيس من جامعة سانت لويس منحت لWSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
References
- Weiss, E., Maness, P., Lauder, J. Why do neurotransmitters act like growth factors? Perspect Dev Neurobiol. 5, 323-335 Forthcoming.
- Herlenius, E., Lagercrantz, H. Neurotransmitters and neuromodulators during early human development. Early Hum. Dev. 65, 21-37 Forthcoming.
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sodhi, M., Sanders-Bush, E.
- Goldberg, J., Kater, S. Expression and function of the neurotransmitter serotonin during development of the Helisoma nervous system. Dev. Biol. 131, 483-495 (1989).
- Goldberg, J. Serotonin regulation of neurite outgrowth in identified neurons from mature and embryonic Helisoma triyolvis. Perspect Dev Neurobiol. 5, 373-387 (1998).
- Haydon, P., McCobb, P., Kater, S. Serotonin selectively inhibits growth cone motility and synaptogenesis of specific identified neurons. Sci. 226, 561-564 (1984).
- Neckameyer, W. S. A trophic role for serotonin in the development of a simple feeding circuit. Dev. Neurosci. 32, 217-237 Forthcoming.
- De Vry, J., Schreiber, R. Effects of selected serotonin 5-HT 1 and 5-HT 2 receptor agonists on feeding behavior: possible mechanisms of action. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 341-353 (2000).
- Schoofs, A., Niederegger, S., van Ooyen, A., Heinzel, H., Spieß, R. The brain can eat: Establishing the existence of a central pattern generator for feeding in third instar larvae of Drosophila virilis and Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 56, 695-705 (2010).
- Spieß, R., Schoofs, A., Heinzel, H. Anatomy of the stomatogastric nervous system associated with the foregut in Drosophila melanogaster and Calliphora vicin third instar larvae. J. Morphol. 269, 272-282 (2008).
- Neckameyer, W. S., Bhatt, P. Neurotrophic actions of dopamine on the development of a serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster. Biomed Cent NeuroSci. 13, 26 (2012).
- Sewall, D., Burnet, B., Connolly, K. Genetic analysis of larval feeding behavior in Drosophila melanogaste. Genet. Res. 24, 163-173 (1975).
- Joshi, A., Mueller, L. Evolution of higher feeding rate in Drosophila due to density-dependent natural selection. Evolution. 42, 1090-1093 (1988).
- Budnik, V., Wu, C., White, K. Altered branching of serotonin-containing neurons in Drosophila mutants unable to synthesize serotonin and dopamine. J. Neurosci. 9, 2866-2877 (1989).
- Sykes, P., Condron, B. Development and sensitivity to serotonin of Drosophila varicosities in the central nervous system. Dev. Biol. 286, 207-216 (2005).
- Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis inC. elegansand Drosophila. Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).
- McKemy, D. D.
