Efter i Real Time konsekvenserne af Pneumokok virulensfaktorer i en akut Mouse Lungebetændelse Model Brug Bioluminescent Bakterier
Summary
Streptococcus pneumoniae er den førende patogen forårsager alvorlige community-erhvervet pneumoni og ansvarlig for over 2 millioner dødsfald på verdensplan. Kan følges op på virkningen af bakterielle faktorer impliceret i fitness eller virulens i realtid i en akut mus lungebetændelse eller bakteriæmi model ved hjælp af selvlysende bakterier.
Abstract
Lungebetændelse er en af de store sundhedsvæsenets problemer i udviklingslandene og de industrialiserede lande og er forbundet med betydelig sygelighed og dødelighed. Trods fremskridt i viden om denne sygdom, tilgængeligheden af intensivafdelinger (ICU), og brugen af potente antimikrobielle stoffer og effektive vacciner, dødeligheden fortsat høje 1.. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Dette patogen er udstyret med en udrustning af overflade-eksponerede adhæsinerne og virulens faktorer, der bidrager til lungebetændelse og invasiv pneumokoksygdom (IPS). Vurderingen af in vivo rollen af bakterielle fitness eller virulensfaktorer er af allerstørste betydning at trævle S. pneumoniae patogenicitet mekanismer. Murine modeller af lungebetændelse, bakteriæmi og meningitis bliver brugt til at fastslå virkningen af pneumokok-faktorer ved difskellige faser af infektionen. Her beskriver vi en protokol til at overvåge i realtid pneumokok udbredelse i mus efter intranasal eller intraperitoneal infektioner med selvlysende bakterier. Resultaterne viser formering og spredning af pneumokokker i de nedre luftveje og blod, som kan visualiseres og evalueres ved hjælp af et billedbehandlingssystem og den ledsagende analyse software.
Introduction
Luftvejsinfektioner forårsaget af virus eller bakterier er fortsat en af de mest almindelige samfunds-erhvervet eller kliniske problemer på verdensplan forårsager cirka en tredjedel af alle dødsfald på verdensplan. De vigtigste bakteriearter er Haemophilus influenzae og Streptococcus pneumoniae 2. Men disse bakteriearter er normalt fælles bestanddele af den naturlige luftveje flora. Således bakteriel vogn er også vis risiko for invasiv sygdom og afhængig af immunstatus eller forfordele af enkeltpersoner. Den asymptomatisk kolonisering udløses til invasive infektioner. Streptococcus pneumoniae er den førende patogen af community-erhvervet pneumoni (CAP) og en af de mest almindelige årsager til bakteriæmi hos mennesker. Hos raske individer S. pneumoniae (pneumokokker) er ofte asymptomatiske og harmløse kolonisatorer i de øvre luftveje, hvor de konfronteres med nonpathogenic bakterieraf de bosiddende flora, men også med patogener, såsom Haemophilus spp. eller Staphylococcus aureus og den første linje af det menneskelige immunforsvar. Carriage er højest i små børn (37%) og endnu højere i overfyldte daginstitutioner (58%) 3-5. Den yngste befolkning og de ældre, der modtager pneumokokker via aerosol transmission fra luftfartsselskaber og nasopharynx sekreter 6, hører til de højrisikogrupper og vaccination ved hjælp af en af de pneumokok konjugerede vacciner (PCV10 eller PCV13 hos børn og 23-valent polysaccharid PPSV23 hos voksne) anbefales i USA (US) og mange europæiske lande 4. Den PPSV23 dækker serotyper, der er ansvarlige for ~ 90% af de bakteriæmiske pneumokok-sygdomme i USA og Europa, som forhindrer dermed effektivt invasiv pneumokoksygdom sygdomme (IPD) hos voksne, mens PCVs dækker de mest udbredte serotyper i børn. Følgelig IPD grund af vaccine typer (VT) er reducerede men nonvaccine serotyper viser en høj virulens potentiale og antibiotikaresistens er dukket 4,7-12. Nasopharynx som reservoiret er udgangspunktet for pneumokokker at sprede sig til bihulerne eller midterste ører initierende skadelige lokale infektioner. Mere vigtigt, pneumokokker spredes direkte via luftvejene til bronkierne og lungerne resulterer i livstruende CAP 4,13. Lungeinfektioner er ofte ledsaget med væv og ødelæggelse barriere, således at patogenet spredes i blodet og forårsager IPD. Forekomsten af den fælles landbrugspolitik og IPD er højest i immunsvækkede personer eller i de yderste områder af alder 4,13. De omstændigheder, der er ansvarlige for omdannelsen fra en commensal for et patogen med høj virulens er stadig under debat. Imidlertid har foruden ændringer i host modtagelighed og evolutionær tilpasning ledsaget med højere virulens og stigningen i antibiotikaresistenser blevet foreslået at have en afgørende indflydelse på PNEumococcal infektioner 14-16.
Patogenet er udstyret med en flerhed af adhæsiner, der medierer intim kontakt til mukosale epitelceller. Efter overvindelsen af den luftvejs slim, er pneumokok vedhæftning til værtsceller lettes via direkte interaktioner af overfladeeksponerede adhesiner med cellulære receptorer og ved at udnytte ekstracellulære matrix komponenter eller serumproteiner som bro molekyler 4,17,18. Som alsidige patogener pneumokoktyper er også udstyret med faktorer involveret i unddragelse af værtens immun forsvarsmekanismer. Desuden har de evnen til at tilpasse til forskellige host miljøer såsom lunge, blod og cerebrospinalvæske (CSF), henholdsvis 5,17,19,20.
Virkningen af bakterielle faktorer patogenese og inflammatoriske værtsresponser er undersøgt i eksperimentelle dyremodeller for lungebetændelse, bakteriæmi eller meningitis 21-25. Trods et humant patogen, disse modeller er vill-etableret for at dechifrere pneumokok væv tropisme, virulens mekanismer eller protectivity af pneumokokvaccine kandidater. Den genetiske baggrund af indavlede musestammer bestemmer modtagelighed for pneumokokker. BALB / c-mus intranasalt inficeret med pneumokokker blev fundet at være resistente, mens CBA / Ca-og SJL-mus var mere modtagelige over for pneumokokinfektioner 22. Dette indebærer, at ligner mennesker, den genetiske baggrund og værtsforsvarsmekanismer bestemme udfaldet af infektionen. Derfor er det nødvendigt at opklare modstand loci i genomet af mus mindre modtagelige for pneumokokinfektioner yderligere indsats. Resultaterne har ført til ændringer i in vivo virulens protokoller. I stedet for de indavlede BALB / c mus, der ofte anvendes i fortiden, er de meget modtagelige CD-1/MF1 udavlede musestammer dag ofte bruges til at undersøge effekten af tab af funktion pneumokok virulens eller fitness faktorer 26-28. Desuden er tilgængelighedenaf bioluminescerende pneumokokker og optiske billeddannende teknikker tillader tidstro bioluminescens Bioimaging infektioner. I pneumokokker er indsat den optimerede luxABCDE genkassette (plasmid Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km R) i en enkelt integration stedet for kromosomet ved transposon mutagenese. Bioluminiscerende pneumokokker er blevet anvendt til at vurdere dæmpningen af pneumokok mutanter med mangelfuld virulens eller fitness faktorer og deres translokation fra en anatomisk websted til et andet 26,28-31.
Her giver vi en protokol for bioimaging af pneumokok infektioner i en murin lungebetændelse eller sepsis model. Forstærkning og formidling af bioluminiscerende pneumokokker i intranasalt eller intraperitonealt inficerede mus kan nemt overvåges over tid ved hjælp af et optisk imaging system, og det samme dyr på forskellige tidspunkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle eksperimenter udført i dyr skal godkendes af de lokale myndigheder og etik provisioner. I in vivo infektion eksperimenter den bakterielle belastning i de forskellige host nicher af inficerede dyr skal bestemmes på forskellige tidspunkter efter infektion. Under disse eksperimentelle forhold har de dyr, der skal ofres, før isolering af bakterier fra blodet, nasopharynx, bronchoalvelar udskylning, eller organer såsom lunger, milt og hjerne. For at beregne antallet af bakterier pr vært niche og vurd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) og Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) Medicinsk Infektion Genomics (FKZ 0315828A) til SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
Referências
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P., Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm, , et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
