Summary

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Published: February 23, 2014
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Summary

肺炎球菌は、重症市中肺炎、世界中200万人以上の死亡の原因を引き起こす主要な病原体である。フィットネスまたは病原性に関与する細菌性因子の影響は、生物発光細菌を用いて、マウスの急性肺炎または菌血症モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができる。

Abstract

肺炎は、開発における主要なヘルスケアの問題や先進国の一つであり、かなりの罹患率と死亡率と関連している。この病気の知識、集中治療室(ICU)のアベイラビリティ、および強力な抗菌剤で効果的なワクチンの使用の進歩にもかかわらず、死亡率は1高止まり。 肺炎球菌は市中肺炎(CAP)の主要病原体であるおよびヒトにおける菌血症の最も一般的な原因の1。この病原体は、表面に露出した付着因子と肺炎や侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)に貢献する毒性因子の装備一式が装備されています。細菌の毒性因子又は適応度のインビボでの役割の評価は、S.を解明するために最も重要である肺炎病原性メカニズム。肺炎、菌血症、および髄膜炎のマウスモデルは、DIFにおける肺炎球菌の因子の影響を決定するために使用されている感染の段階をferent。ここでは、鼻腔内、または生物発光細菌による腹腔内感染後のマウスでのリアルタイム肺炎球菌普及に監視するためのプロトコルを記述します。その結果、撮像システム及び添付分析ソフトウェアを用いて視覚化し、評価することができる下気道および血液中の乗算と肺炎球菌の普及を示す。

Introduction

ウイルスや細菌によって引き起こされる気道感染症は、世界中のすべての死の約3分の1を引き起こし、世界中の最も一般的な市中または臨床的問題の1つとなっています。キー細菌種は、 インフルエンザ菌肺炎球菌 2である。しかし、これらの細菌種は、通常、自然な気道内細菌叢の一般的な構成要素である。このように、細菌の送料は侵襲性疾患および免疫状態や個人の素因に依存するため、特定の危険性もある。無症候性の保菌は、侵襲性感染症にトリガされます。 肺炎球菌は、市中肺炎(CAP)およびヒトにおける菌血症の最も一般的な原因の1の主要な病原体である。健常者におけるS.肺炎球菌 (肺炎球菌)は、多くの場合、彼らは非病原性細菌に直面している上気道の無症候性および無害植民ですだけでなく、 ヘモフィルス属などの病原体と常在菌叢の。または黄色ブドウ球菌とヒトの免疫防御システムの最初の行。キャリッジ率は幼児で最も高い(37%)と3-5(58%)混雑したデイケアセンター内でさらに高い。最年少の人口と高齢者は、担体及び鼻咽頭分泌物6からのエアゾール変速機を介して肺炎を受け、肺炎球菌コンジュゲートワクチン(成人では、子供と23価多糖PPSV23におけるPCV10またはPCV13)のいずれかを使用して、高リスク群とワクチン接種に属しアメリカ合衆国(米国)、多くの欧州諸国4で推奨されている。格納容器は、小児の最も一般的な血清型をカバーしながら、PPSV23は、成人では効率的に侵襲性肺炎球菌疾患(IPD)の防止、米国と欧州の菌血症肺炎球菌疾患の約90%を占める血清型をカバーしています。その結果、IPDは、ワクチンの種類(VT)にREDUです高病原性の可能性や抗生物質耐性を表示するCEDが、nonvaccine血清型が4,7-12浮上ている。リザーバとして咽頭は、有害なローカル感染を開始する副鼻腔や中耳に広めるために肺炎球菌の出発点である。さらに重要なのは、肺炎球菌は、生命を脅かすCAP 4,13結果気管支や肺に気道から直接広がった。肺感染症は、多くの場合、このように血液中に広めるために、病原体を可能にし、IPDを引き起こし、組織およびバリア破壊に伴う。 CAPとIPDの発生率は、免疫不全の人で、年齢4,13の極値で最も高い。高病原性と病原体への共生の変換を担う状況が議論中である。しかし、より高い毒性および抗生物質耐性の増加を伴う宿主の感受性および進化適応の変化の他にPNEに決定的な影響を有することが示唆されているumococcal感染14〜16。

病原体は、上皮細胞の粘膜の密接な接触を仲介する付着因子の多様性に恵まれている。気道粘液を乗り越えた後、宿主細胞への肺炎球菌の付着は、細胞受容体との表面露出アドヘシンの直接的な相互作用を介して分子の4,17,18を架橋するように細胞外マトリックス成 ​​分または血清タンパク質を利用することによって促進される。としての汎用性の高い病原体の肺炎球菌も宿主の免疫防御機構の回避に関与する因子を完備しています。さらに、それらは、それぞれ、肺、血液、および脳脊髄液(CSF)、5,17,19,20等の種々の宿主的環境に適応する能力を有する。

病因および炎症応答ホスト上の細菌の要因の影響は、肺炎、菌血症、髄膜炎または21〜25の実験動物モデルにおいて調査されている。ヒトの病原体であるにもかかわらず、これらのモデルは、我々はLL-確立肺炎球菌組織向性、病原性のメカニズム、または肺炎球菌ワクチン候補の保護性を解読する。近交系マウス系統の遺伝的背景は、肺炎球菌に対する感受性を決定します。 CBA / CaおよびSJLマウスは、肺炎球菌感染22に対してより感受性あったが、鼻腔内肺炎球菌に感染したBALB / cマウスを、耐性であることが見出された。これは、ヒト、遺伝的背景および宿主防御機構と同様の感染の結果を決定する、ことを意味する。したがって、さらなる努力が肺炎球菌感染症に対してより感受性マウスのゲノムに耐性座を解明するために必要である。知見は、 インビボ病原性プロトコルの変更につながっている。代わりに、多くの場合、過去に使用された近交系BALB / cマウスの、非常に敏感CD-1/MF1近交系マウス系統は、今日では、多くの場合、機能喪失肺炎球菌、病原性や適性26-28因子の影響を研究するために使用されています。また、可用性生物発光肺炎球菌および光学イメージング技術の感染症のリアルタイム生物発光バイオイメージングが可能になる。肺炎球菌では、最適化されたluxABCDE遺伝子カセット(プラスミドポール·Tnは4001たluxABCDEのKm r)は 、トランスポゾン突然変異誘発により染色体の単一の組み込み部位に挿入されている。生物発光肺炎球菌は病原性または適性の要因別26,28-31に1解剖学的部位からの転座を欠損肺炎球菌の変異体の減衰を評価するために使用されてきた。

ここでは、マウスの肺炎や敗血症モデルにおける肺炎球菌感染症のバイオイメージングのためのプロトコルを提供する。鼻腔内または腹腔内に感染させたマウスにおける増幅および生物発光肺炎球菌の普及が容易に異なる時点で撮像光学系と同じ動物を用いて経時的にモニターすることができる。

Protocol

ここで説明した動物感染実験は、脊椎動物動物の使用のために( 例えば実験動物学協会連合会の欧州衛生法(FELASA))のガイドラインや規制のローカルおよび国際的に厳密に従って実行する必要があります。実験は、地域の倫理委員会および動物実験委員会によって承認されなければならない。 Sにすべての実験実験室または動物の感染症、肺炎は、クラスIIバイオセー?…

Representative Results

メチオニンの取得及び取り込みは、そのホストのニッチ32,33内のフィットネスを維持するために、肺炎球菌のための中心的な重要性である。メチオニンABCトランスポーターリポ蛋白は、SPD _ 0151遺伝子(TIGR4:sp_0149)でD39でエンコードされており、MetQ 32という。 ( – ; TIGR4 Sp_0585 – Sp_0586、METEとMETF Spd_0511 Spd_0510 D39)肺炎球菌はさらに、メチオニン生合成酵?…

Discussion

動物を用いて実施し、すべての実験は、地方自治体や倫理委員会によって承認されなければならない。 インビボ感染実験において、感染した動物の種々の宿主ニッチにおける細菌負荷は、様々な時点で、感染後に決定されなければならない。これらの実験条件下での動物は前の血液、咽頭、bronchoalvelar洗浄、あるいは、肺、脾臓、および脳などの臓器からの細菌の単離犠牲にしな?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

研究室での研究は、SHにドイツ学術振興(DFG HA 3125/3-2、DFG HA 3125/4-2)と、教育研究連邦省(BMBF)医療感染ゲノミクス(FKZ 0315828A)からの補助金によって支えられている。

Materials

Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376
fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok™ syringes with needle
Gel Loader Tips peqlab 81-13790 MµltiFlex™ Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001
Isofluoran Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit Qiagen, Hilden, Germany 27104
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106
Equipment
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany

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Citar este artigo
Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

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