A seguito in tempo reale l'impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti
Summary
Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale che causa una grave polmonite acquisita in comunità e responsabile per oltre 2 milioni di decessi in tutto il mondo. L'impatto dei fattori batterici implicati in palestra o virulenza può essere monitorato in tempo reale in un mouse polmonite o batteriemia modello acuta con batteri bioluminescenti.
Abstract
La polmonite è uno dei principali problemi sanitari in via di sviluppo e paesi industrializzati ed è associata ad una considerevole morbilità e mortalità. Nonostante i progressi nella conoscenza di questa malattia, la disponibilità di unità di terapia intensiva (ICU), e l'uso di agenti antimicrobici potenti e vaccini efficaci, i tassi di mortalità restano elevati 1. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle cause più comuni di batteriemia nell'uomo. Questo patogeno è dotato di un armamentario di adesine-superficie a vista e fattori di virulenza che contribuiscono alla polmonite e malattia pneumococcica invasiva (IPD). La valutazione del ruolo in vivo di fattori di forma fisica o di virulenza batterica è della massima importanza per svelare S. meccanismi di patogenicità pneumoniae. Modelli murini di polmonite, batteriemia e meningite vengono utilizzati per determinare l'impatto dei fattori pneumococco a difrenti fasi dell'infezione. Qui si descrive un protocollo per il monitoraggio in tempo reale diffusione pneumococcica nei topi dopo intranasale o infezioni intraperitoneale con batteri bioluminescenti. I risultati mostrano la moltiplicazione e la diffusione di pneumococchi nel tratto respiratorio inferiore e sangue, che può essere visualizzata e valutata utilizzando un sistema di imaging e il software di analisi di accompagnamento.
Introduction
Infezioni del tratto respiratorio causate da virus o batteri rimangono uno dei problemi acquisite in comunità o cliniche più comuni in tutto il mondo provocando circa un terzo di tutte le morti in tutto il mondo. Le specie batteriche chiave sono Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. Tuttavia, queste specie batteriche sono normalmente costituenti comuni delle naturali flora del tratto respiratorio. Così carrozza batterica è anche di certo rischio di malattia invasiva e seconda dello stato immunitario o predisposizioni degli individui. La colonizzazione asintomatica è attivato per infezioni invasive. Streptococcus pneumoniae è il patogeno principale della polmonite acquisita in comunità (CAP) e una delle più comuni cause di batteriemia negli esseri umani. Negli individui sani S. pneumoniae (pneumococco) sono spesso colonizzatori asintomatici e innocuo del tratto respiratorio superiore, dove si trovano a confrontarsi con i batteri non patogenidella flora residente, ma anche con agenti patogeni come Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus e la prima linea di difesa del sistema immunitario umano. Tariffe di spedizione sono più alti nei bambini (37%) e persino più alto in centri diurni affollati (58%), 3-5. La popolazione più giovane e gli anziani, ricevendo il pneumococco via di trasmissione per aerosol da vettori e secrezioni naso-faringei 6, appartengono ai gruppi ad alto rischio e la vaccinazione utilizzando uno dei vaccini pneumococcico coniugato (PCV10 o PCV13 nei bambini e 23-valente polisaccaridico PPSV23 negli adulti) è raccomandato negli Stati Uniti (US) e molti paesi europei 4. Il PPSV23 copre sierotipi responsabili di ~ 90% delle malattie pneumococciche batteriemia negli Stati Uniti e in Europa, prevenzione delle malattie pneumococciche così efficiente invasive (IPD) negli adulti, mentre i PCVs coprono i sierotipi più frequenti nei bambini. Di conseguenza, IPD a causa di tipi di vaccino (VT) sono ridusierotipi non vaccinali CED ma che mostrano un alto potenziale di virulenza e di resistenza agli antibiotici sono emerse 4,7-12. Il rinofaringe come il serbatoio è il punto di partenza per pneumococchi a diffondersi i seni o le orecchie di mezza avvio infezioni locali nocivi. Più importante, pneumococchi diffondere direttamente attraverso le vie respiratorie di bronchi e del polmone con conseguente pericolo di vita CAP 4,13. Infezioni polmonari sono spesso accompagnate con il tessuto e distruzione barriera, permettendo così al patogeno di diffondersi nel sangue e causando IPD. L'incidenza di PAC e IPD sono più elevati nei soggetti immunocompromessi o agli estremi di 4,13 anni. Le circostanze responsabili per la conversione da un commensale con un patogeno con elevata virulenza sono ancora in discussione. Tuttavia, oltre a cambiamenti nella suscettibilità dell'ospite e adattamento evolutivo accompagnato con maggiore virulenza e l'aumento delle resistenze agli antibiotici sono stati suggeriti per avere un impatto cruciale sul pneinfezioni umococcal 14-16.
L'agente patogeno è dotato di una molteplicità di adesine che mediano contatto intimo alle cellule della mucosa epiteliali. Dopo aver superato il muco delle vie respiratorie, l'adesione pneumococcica alle cellule ospiti è facilitato tramite interazioni dirette di adesine-superficie esposta con recettori cellulari e sfruttando componenti della matrice extracellulare o proteine del siero come colmare le molecole 4,17,18. Agenti patogeni come versatili pneumococchi sono anche dotati di fattori coinvolti in evasione dei meccanismi di difesa dell'ospite immunitario. Inoltre, essi hanno la capacità di adattarsi a diversi ambienti host quali il polmone, del sangue e del liquido cerebrospinale (CSF), rispettivamente, 5,17,19,20.
L'impatto dei fattori batterici sulla patogenesi e di accoglienza infiammatoria risposte è studiato in modelli animali sperimentali di polmonite, batteriemia o meningite 21-25. Pur essendo un agente patogeno umano, questi modelli sono noill-istituito per decifrare tropismo tissutale pneumococco, meccanismi di virulenza, o protectivity dei candidati vaccino pneumococcico. Il background genetico dei ceppi inbred topo determina la suscettibilità di pneumococchi. Topi BALB / c intranasale infettate con pneumococchi sono risultati essere resistenti, mentre CBA / Ca e SJL topi erano più suscettibili contro le infezioni pneumococciche 22. Ciò implica che, simili agli esseri umani, il background genetico e dei meccanismi di difesa dell'ospite determinano il risultato dell'infezione. Pertanto, sono necessari ulteriori sforzi per svelare la resistenza loci nel genoma dei topi meno suscettibili alle infezioni da pneumococco. I risultati hanno portato a cambiamenti in vivo protocolli di virulenza in. Invece dei consanguinei topi BALB / c, spesso utilizzate in passato, i altamente sensibili CD-1/MF1 ceppi outbred topi sono oggi spesso utilizzati per studiare l'effetto di virulenza pneumococcica o idoneità perdita-di-funzione di fattori 26-28. Inoltre, la disponibilitàdi pneumococchi bioluminescenti e tecniche di imaging ottico permette la bioluminescenza bioimmagini in tempo reale delle infezioni. In pneumococchi la cassetta genica luxABCDE ottimizzato (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) è stata inserita in un sito di integrazione singola del cromosoma da trasposone mutagenesi. Pneumococchi bioluminescenti sono stati impiegati per valutare l'attenuazione dei mutanti di pneumococco con deficit di virulenza o di idoneità fattori e la loro traslocazione da un sito anatomico all'altro 26,28-31.
Qui forniamo un protocollo per la bioimmagini di infezioni pneumococciche in una polmonite o modello murino di sepsi. Amplificazione e diffusione di pneumococchi bioluminescente in topi infettati per via intraperitoneale, intranasale o possono essere facilmente monitorati nel tempo utilizzando un sistema di imaging ottico e lo stesso animale a tempi diversi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tutti gli esperimenti condotti su animali devono essere approvati dalle autorità locali e di etica commissioni. In esperimenti di infezione in vivo la carica batterica nelle varie nicchie che ospitano animali infetti deve essere determinato in vari momenti dopo l'infezione. In queste condizioni sperimentali, gli animali devono essere sacrificati prima che l'isolamento dei batteri dal sangue, rinofaringe, il lavaggio bronchoalvelar o organi come i polmoni, milza e cervello. Per calcolare il numero…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca in laboratorio è stata sostenuta da sovvenzioni da parte del Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) e il Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) Genomica Infezione Medical (FKZ 0315828A) a SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
Referências
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