Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën
Summary
Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.
Abstract
Longontsteking is een van de grootste problemen in de gezondheidszorg in ontwikkelingslanden en geïndustrialiseerde landen en wordt geassocieerd met een aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Ondanks de vooruitgang in kennis van deze ziekte, de beschikbaarheid van intensive care units (ICU), en het gebruik van krachtige antimicrobiële middelen en effectieve vaccins, de sterftecijfers hoog blijven 1. Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende pathogeen van community-acquired pneumonie (CAP) en een van de meest voorkomende oorzaken van bacteriëmie bij mensen. Dit organisme is uitgerust met een arsenaal van oppervlakte blootgestelde adhesinen en virulentie factoren longontsteking en invasieve pneumokokken (IPD). De evaluatie van de in vivo rol van bacteriële fitness of virulentie factoren is van het grootste belang te ontrafelen S. pneumoniae pathogeniteit mechanismen. Murine modellen pneumonie, bacteriëmie en meningitis worden gebruikt om het effect van pneumokokken factoren verschil bepalenlende stadia van de infectie. Hier beschrijven we een protocol om in real-time pneumokokken verspreiding in muizen na intranasale of intraperitoneale infecties met bioluminescentie bacteriën. De resultaten tonen de replicatie en verspreiding van pneumokokken in de onderste luchtwegen en bloed, die kunnen worden gevisualiseerd en geëvalueerd middels een afbeeldingssysteem en de bijbehorende analyse software.
Introduction
Luchtweginfecties veroorzaakt door virussen of bacteriën blijven een van de meest voorkomende gemeenschap verworven of klinische problemen veroorzaakt wereldwijd ongeveer een derde van alle overlijden wereldwijd. De belangrijkste bacteriële soorten Haemophilus influenzae pt Streptococcus pneumoniae 2. Echter, deze bacteriesoorten gewoonlijk voorkomende bestanddelen van de natuurlijke luchtwegen flora. Aldus bacteriële wagen ook zeker risico voor invasieve ziekten en afhankelijk van de immuunstatus of predisposities van de individuen. De asymptomatische kolonisatie wordt geactiveerd om invasieve infecties. Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende pathogeen van community-acquired pneumonie (CAP) en een van de meest voorkomende oorzaken van bacteriëmie bij de mens. Bij gezonde individuen S. pneumoniae (pneumokokken) zijn vaak asymptomatisch en onschadelijk kolonisatoren van de bovenste luchtwegen, wanneer zij worden geconfronteerd met niet-pathogene bacteriënvan de bewoner flora maar ook met ziekteverwekkers zoals Haemophilus spp. of Staphylococcus aureus en de eerste regel van het menselijke immuunsysteem afweersysteem. Vervoer tarieven zijn het hoogst bij jonge kinderen (37%) en zelfs hoger in overvolle opvangcentra (58%) 3-5. De jongste bevolking en ouderen, het ontvangen van de pneumokok via aërosol-transmissie van vervoerders en nasopharyngeal afscheidingen 6, behoren tot de risicogroepen en vaccinatie met behulp van een van de pneumokokken conjugaat vaccins (PCV10 of PCV13 bij kinderen en 23-valent polysaccharide PPSV23 bij volwassenen) wordt aanbevolen in de Verenigde Staten (VS) en vele Europese landen 4. De PPSV23 dekt serotypen verantwoordelijk voor ~ 90% van de bacteremic pneumokokken ziekten in de VS en Europa, het voorkomen zo effectief invasieve pneumokokken ziekten (IPD) bij volwassenen, terwijl de PCVs betrekking op de meest voorkomende serotypen bij kinderen. Bijgevolg IPD vanwege types vaccin (VT) zijn ReduCED maar nonvaccine serotypen weergeven van een hoge virulentie en antibioticumresistentie ontstaan 4,7-12. De nasopharynx als het reservoir is het startpunt voor pneumokokken te verspreiden naar de sinussen of middelste oren initiëren van schadelijke lokale infecties. Belangrijker, pneumokokken rechtstreeks verspreid via de luchtwegen naar de bronchiën en longen resulteert in levensbedreigende CAP 4,13. Longinfecties gaan vaak gepaard met weefsel en barrière vernietiging, waardoor het pathogeen te verspreiden in het bloed en veroorzaakt IPD. Incidentie van GLB en IPD zijn het hoogst in immuungecompromitteerde personen of bij de uitersten van leeftijd 4,13. De omstandigheden die verantwoordelijk is voor de omzetting van een commensaal een ziekteverwekker met een hoge virulentie zijn nog in discussie. Echter, naast veranderingen in de ontvangende gevoeligheid en evolutionaire aanpassing gepaard met hogere virulentie en de toename antibioticaresistenties zijn zouden een belangrijke invloed hebben op pneumococcal infecties 14-16.
De ziekteverwekker is begiftigd met een veelheid van adhesines bemiddelen intiem contact te epitheelcellen mucosale. Na het overwinnen van de luchtwegen slijm, wordt pneumokokken aanhankelijkheid aan gastheercellen gefaciliteerd via directe interactie van het oppervlak blootgestelde adhesines met cellulaire receptoren en door de exploitatie van extracellulaire matrix componenten of serum-eiwitten als overbrugging moleculen 4,17,18. Zo veelzijdig ziekteverwekkers pneumokokken zijn ook uitgerust met factoren betrokken bij ontduiking van gastheer immune afweermechanismen. Bovendien hebben zij het vermogen tot aanpassing aan verschillende ontvangende milieus zoals de longen, bloed en cerebrospinale vloeistof (CSF), respectievelijk 5,17,19,20.
De impact van bacteriële factoren op de pathogenese en inflammatoire gastheer responsen wordt onderzocht in experimentele diermodellen van longontsteking, bacteriëmie of meningitis 21-25. Ondanks dat het een menselijk pathogeen, deze modellen zijn wijll-opgericht om pneumokokken weefseltropisme, virulentie mechanismen, of protectivity van pneumokokkenvaccin kandidaten ontcijferen. De genetische achtergrond van inteelt muizenstammen bepaalt de gevoeligheid voor pneumokokken. BALB / c muizen intranasaal geïnfecteerd met pneumococcen bleken resistent te zijn, terwijl CBA / Ca en SJL muizen gevoeliger tegen pneumokokkeninfecties 22. Dit betekent dat, gelijkaardig aan mensen, de genetische achtergrond en de gastheer afweermechanismen bepalend voor de uitkomst van de infectie. Vandaar dat verdere inspanningen nodig zijn om de weerstand loci ontrafelen in het genoom van de muizen minder gevoelig voor pneumokokkeninfecties. De bevindingen leidden tot veranderingen in virulentie in vivo protocollen. In plaats van de ingeteelde BALB / c muizen vaak gebruikt in het verleden, zijn de zeer gevoelige CD-1/MF1 outbred muizenstammen tegenwoordig vaak gebruikt om het effect van het verlies-van-functie pneumococcen virulentie factoren of geschiktheid 26-28 bestuderen. Bovendien beschikbaarheidvan bioluminescente pneumokokken en optische beeldvormingstechnieken kan de real-time bioluminescentie bioimaging infecties. In pneumococcen de geoptimaliseerde luxABCDE gencassette (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Kmr) ingevoegd in een integratieplaats van het chromosoom door transposon mutagenese. Bioluminescentie pneumococcen zijn gebruikt om de demping van pneumococcen mutanten tekort aan virulentie of geschiktheid factoren en de translocatie ve anatomische plaats naar de andere 26,28-31 beoordelen.
Hier bieden wij een protocol voor de bioimaging van pneumokokkeninfecties in een muizen-pneumonie of sepsis model. Amplificatie en verspreiding van bioluminescente pneumokokken in intranasaal of intraperitoneaal geïnfecteerde muizen kunnen eenvoudig worden gevolgd in de tijd met behulp van een optisch afbeeldingssysteem en hetzelfde dier op verschillende tijdstippen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle experimenten bij dieren hebben door de lokale overheden en ethische commissies worden goedgekeurd. In in vivo infectie experimenten de bacteriële verontreiniging in de verschillende gastheer niches van besmette dieren moet worden bepaald op verschillende tijdstippen na infectie. Onder deze experimentele omstandigheden de dieren worden opgeofferd voor de isolatie van de bacteriën uit het bloed, nasopharynx, bronchoalvelar lavage of organen zoals de longen, milt en hersenen. Om het aantal bacteriën …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het laboratorium werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) en het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) Medische Infectie Genomics (FKZ 0315828A) naar SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
Referências
- Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
- WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
- Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
- Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
- Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
- Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
- Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
- Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
- Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
- Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
- Lynch, J. P., Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
- Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
- Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
- Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
- Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
- Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
- Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
- Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
- Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
- Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
- Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
- Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
- Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
- Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
- Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
- Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
- Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
- Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
- Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
- Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
- Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
- Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
- Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
- Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
- vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
- Brehm, , et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).
