A seguir em tempo real o impacto de fatores de virulência do pneumococo em um mouse Pneumonia aguda Modelo Usando bactérias bioluminescentes
Summary
Streptococcus pneumoniae é o patógeno principal causador da pneumonia adquirida na comunidade grave e responsável por mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. O impacto dos fatores bacterianos implicados em fitness ou virulência pode ser monitorado em tempo real em uma pneumonia ou bacteremia modelo aguda mouse usando bactérias bioluminescentes.
Abstract
A pneumonia é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento e países industrializados e está associada com morbidade e mortalidade considerável. Apesar dos avanços no conhecimento desta doença, a disponibilidade de unidades de terapia intensiva (UTI), eo uso de antimicrobianos potentes e vacinas efetivas, as taxas de mortalidade continuam altas 1. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Este patógeno é equipado com um arsenal de adesinas de superfície exposta e fatores de virulência que contribuem para pneumonia e doença pneumocócica invasiva (DPI). A avaliação do papel in vivo de aptidão ou de virulência fatores bacterianos é de extrema importância para desvendar S. mecanismos de patogenicidade pneumoniae. Modelos murinos de pneumonia, bacteremia e meningite estão sendo usados para determinar o impacto de fatores pneumocócicas em difrente fases da infecção. Aqui nós descrevemos um protocolo para monitorar em tempo real a divulgação pneumocócica em ratos após intranasal ou infecções intraperitoneais com bactérias bioluminescentes. Os resultados mostram a multiplicação e difusão de pneumococos no tracto respiratório inferior e do sangue, que pode ser visualizado e avaliada utilizando um sistema de imagem e o software de análise que a acompanha.
Introduction
Infecções respiratórias causadas por vírus ou bactérias continuam a ser um dos problemas adquiridas na comunidade ou clínicas mais comuns em todo o mundo, causando cerca de um terço de todas as mortes no mundo inteiro. As espécies de bactérias principais são o Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae 2. No entanto, estas espécies de bactérias são normalmente constituintes comuns da flora natural do tracto respiratório. Assim, a carga bacteriana também é de certo risco para doença invasiva e, dependendo do estado imunitário ou predisposições dos indivíduos. A colonização assintomática é acionado para infecções invasivas. Streptococcus pneumoniae é o principal patógeno da pneumonia adquirida na comunidade (PAC) e uma das causas mais comuns de bacteremia em humanos. Em indivíduos saudáveis S. pneumoniae (pneumococo) são muitas vezes assintomáticas colonizadores e inofensivos do trato respiratório superior, onde são confrontados com bactérias não patogênicasda flora residente, mas também com agentes patogênicos, como Haemophilus spp. ou de Staphylococcus aureus e a primeira linha de defesa do sistema imunitário humano. A freqüência de colonização são os mais altos em crianças pequenas (37%) e ainda mais dentro de creches lotadas (58%) 3-5. A população mais jovem e os idosos, que recebe o pneumococo através da transmissão aerossol de operadoras e secreções nasofaríngeas 6, pertencem aos grupos de alto risco e vacinação utilizando uma das vacinas conjugadas pneumocócicas (PCV10 ou PCV13 em crianças e polissacarídica 23-valente PPSV23 em adultos) É recomendado nos Estados Unidos (EUA) e muitos países europeus 4. O PPSV23 cobre sorotipos responsáveis por ~ 90% das doenças pneumocócicas bacteremia em os EUA e na Europa, evitando, assim, doenças pneumocócicas invasivas de forma eficiente (IPD) em adultos, enquanto as PCVs cobrir os sorotipos mais prevalentes em crianças. Consequentemente, IPD devido a tipos de vacinas (VT) são redusorotipos não incluídos na vacina ced mas exibindo um elevado potencial de virulência e resistência a antibióticos surgiram 4,7-12. A nasofaringe como o reservatório é o ponto de partida para pneumococos a se espalhar para os seios ou orelhas médias iniciando infecções locais prejudiciais. Mais importante ainda, pneumococos espalhar diretamente através das vias aéreas ao brônquios e pulmão, resultando em CAP risco de vida 4,13. Infecções pulmonares são frequentemente acompanhadas com e destruição do tecido de barreira, permitindo que o agente patogénico a propagar-se no sangue e causar IPD. As incidências de PAC e IPD são mais elevados em pessoas imunocomprometidas ou nos extremos da idade 4,13. As circunstâncias responsáveis pela conversão de um comensal a um patógeno com alta virulência ainda estão em debate. No entanto, têm sido sugeridas, além mudanças na suscetibilidade do hospedeiro e adaptação evolutiva acompanhado com maior virulência eo aumento da resistência a antibióticos para ter um impacto crucial sobre PNEinfecções umococcal 14-16.
O patógeno é dotado de uma multiplicidade de adesinas mediando o contato íntimo com as células epiteliais da mucosa. Depois de superar o muco das vias aéreas, a adesão às células hospedeiras pneumocócica é facilitada através de interações diretas de adesinas de superfície exposta com receptores celulares e através da exploração de componentes da matriz extracelular ou proteínas séricas como ponte moléculas 4,17,18. Patógenos tão versátil pneumococos também estão equipados com fatores envolvidos na evasão dos mecanismos de defesa do hospedeiro imune. Além disso, eles têm a capacidade de se adaptar a ambientes diversos hospedeiros, tais como o pulmão, sangue e fluido cerebrospinal (CSF), respectivamente 5,17,19,20.
O impacto dos fatores bacterianos sobre patogênese e inflamatória do hospedeiro respostas é investigada em modelos animais experimentais de pneumonia, bacteremia ou meningite 21-25. Apesar de ser um patógeno humano, estes modelos são nósll-estabelecidos para decifrar tropismo pneumocócica tecidos, mecanismos de virulência, ou protectivity de vacinas pneumocócicas. O fundo genético de linhagens puras determina a susceptibilidade a pneumococos. Ratinhos BALB / c por via intranasal infectados com pneumococos foram consideradas resistentes, enquanto que a CBA / Ca e SJL ratinhos eram mais susceptíveis às infecções pneumocócicas 22. Isto implica que, semelhante aos seres humanos, o fundo genético e os mecanismos de defesa do hospedeiro determinar o resultado da infecção. Por isso, são necessárias para desvendar locos de resistência no genoma de ratinhos menos susceptíveis a infecções por pneumococos esforços suplementares. Os resultados levaram a mudanças na in vivo protocolos de virulência. Em vez dos ratinhos BALB / c consanguíneos muitas vezes utilizados no passado, as estirpes de ratinho outbred CD-1/MF1 altamente sensíveis são hoje em dia, muitas vezes utilizado para estudar o efeito de virulência ou aptidão pneumocócica perda de função factores 26-28. Além disso, a disponibilidadede pneumococos bioluminescente e técnicas de imagem óptica permite que o tempo real de bioluminescência bioimaging de infecções. Em pneumococos a cassete do gene luxABCDE optimizado (plasmídeo Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) foi inserido num local de integração único de cromossoma por mutagénese por transposões. Pneumococos bioluminescente têm sido empregados para avaliar a atenuação de mutantes pneumocócicas deficientes em virulência ou aptidão fatores e sua translocação de um sítio anatômico para outro 26,28-31.
Aqui nós fornecemos um protocolo para a bioimaging das infecções pneumocócicas em uma pneumonia ou modelo murino sepse. A amplificação e disseminação de pneumococos bioluminescente em ratinhos por via intranasal ou por via intraperitoneal infectadas podem ser facilmente monitorizados ao longo do tempo utilizando um sistema de imagiologia óptica e do mesmo animal em diferentes pontos de tempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Todos os experimentos realizados em animais têm de ser aprovados pelas autoridades locais e comissões de ética. Em experiências in vivo de infecção a carga bacteriana nos vários nichos hospedeiras de animais infectados tem de ser determinada a diferentes pontos de tempo após a infecção. Sob estas condições experimentais, os animais têm de ser sacrificados antes do isolamento de bactérias a partir do sangue, a nasofaringe, lavado bronchoalvelar, ou órgãos tais como os pulmões, baço e cér…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisas em laboratório foi apoiado por subsídios da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) e do Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF) Genomics Infecção Médico (FKZ 0315828A) para SH.
Materials
| Todd Hewitt broth | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X936.1 | |
| Yeast extract | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
| Blood agar plates | Oxoid, Wesel, Germany | PB5039A | |
| Kanamycin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany | E6376 | |
| fetal bovine serum (FBS) | PAA Laboratories, Coelbe, Germany | A11-151 | |
| CD-1 mice, female | Charles River, Sulzfeld, Germany | CD1SIFE06W08W | female CD-1 mice, six to eight weeks old |
| Ketamin 500mg, Curamed injection solution | Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany | ||
| Rompun 2%, injection solution | Bayer Animal Health, Monheim, Germany | ||
| BD Plastipak 1 ml syringes | Becton Dickinson, Heidelberg, Germany | 300015 | sterile Luer-Lok™ syringes with needle |
| Gel Loader Tips | peqlab | 81-13790 | MµltiFlex™ Tips |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884-100mg | Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test |
| Oxygen | Air Liquide, Düsseldorf, Germany | M1001L50R2A001 | |
| Isofluoran | Baxter, Unterschleißheim, Germany | ||
| pGEM-T Easy | Promega, Mannheim, Germany | ||
| Oligonucleotides | Eurofins MWG, Ebersberg, Germany | ||
| Qiaprep Spin Midiprep Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 27104 | |
| PCR DNA purification kit | Qiagen, Hilden, Germany | 28106 | |
| Equipment | |||
| Living Image 4.1 software | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| IVIS Spectrum Imaging System | Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany | ||
| Biophotometer | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
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