Etter i Real Time Impact of Pneumokokk virulens faktorer i en akutt Mouse Lungebetennelse Modell Bruke Bioluminescent Bakterier

Summary

Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen forårsaker alvorlig smittsom lungebetennelse og ansvarlig for over 2 millioner dødsfall på verdensbasis. Virkningen av bakterielle faktorer involvert i fitness eller virulens kan overvåkes i sanntid i en akutt mus lungebetennelse eller bakteriemi modell med selvlysende bakterier.

Abstract

Lungebetennelse er en av de største helsevesenet problemer i utviklingsland og industrialiserte land, og er forbundet med betydelig sykelighet og dødelighet. Til tross for fremskritt i kunnskap om denne sykdommen, tilgjengeligheten av intensivavdelinger (ICU), og bruk av potente antimikrobielle midler og effektive vaksiner, dødeligheten forbli høy ^en. Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen av smittsom lungebetennelse (CAP) og en av de mest vanlige årsaker til bakteriemi hos mennesker. Dette patogen er utstyrt med en armamentarium av overflateeksponert adhesiner og virulens faktorer som bidrar til lungebetennelse og invasiv pneumokokksykdom (IPD). Vurderingen av in vivo rollen bakterielle fitness eller virulens faktorer er av største viktighet å rakne S. pneumoniae patogenitet mekanismer. Murine modeller av lungebetennelse, bakteriemi og meningitt blir brukt for å fastslå effekten av pneumokokk faktorer ved forskjellige stadier av infeksjonen. Her beskriver vi en protokoll for å overvåke i sanntid pneumokokk formidling i mus etter intranasal eller intraperitoneal infeksjoner med selvlysende bakterier. Resultatene viser at formering og spredning av pneumokokker i nedre luftveier og blod, som kan bli visualisert og evalueres ved hjelp av et avbildningssystem og den tilhørende analyse-programvare.

Introduction

Luftveisinfeksjoner forårsaket av virus eller bakterier er fortsatt en av de vanligste smittsom eller kliniske problemer på verdensbasis forårsaker om lag en tredjedel av alle dødsfall på verdensbasis. De viktigste bakteriearter er Haemophilus influenzae og Streptococcus pneumoniae ^to. Imidlertid er disse bakteriearter er normalt vanlige bestanddeler av den naturlige luftveis flora. Dermed bakteriell vogn er også av viss risiko for invasiv sykdom og avhengig av immunstatus eller predisposisjoner av enkeltpersoner. Den asymptomatisk kolonisering utløses til invasive infeksjoner. Streptococcus pneumoniae er den ledende patogen av smittsom lungebetennelse (CAP) og en av de vanligste årsakene til bakteriemi hos mennesker. Hos friske individer S. pneumoniae (pneumokokker) er ofte asymptomatiske og ufarlig koloniherrer i de øvre luftveiene, hvor de blir konfrontert med nonpathogenic bakterierav de fastboende flora, men også med patogener som Haemophilus spp.. eller Staphylococcus aureus og den første linjen av menneskets immunforsvar. Vogn priser er høyest hos unge barn (37%) og enda høyere i løpet av overfylte barnehager (58%) ^3-5. Den yngste befolkning og eldre, mottar pneumococcus via aerosol overføring fra operatører og svelgsekreter ^6, hører til de høye risikogrupper og vaksinasjon ved hjelp av en av konjugert pneumokokk vaksine (PCV10 eller PCV13 hos barn og 23-valent polysakkarid PPSV23 hos voksne) anbefales i og mange europeiske land ⁴ USA (US). Den PPSV23 dekker serotyper ansvarlige for ~ 90% av bakteriemi pneumokokksykdommer i USA og Europa, og hindrer dermed effektivt invasiv pneumokokksykdom (IPD) hos voksne, mens de PCVs dekke de mest utbredte serotyper hos barn. Følgelig IPD grunn vaksinetyper (VT) er reduCED men nonvaccine serotyper viser en høy virulens potensial og antibiotikaresistens har dukket ^4,7-12. Nasopharynx som reservoaret er utgangspunkt for pneumokokker å spre seg til bihulene eller mellomøret initiere skadelige lokale infeksjoner. Mer viktig, pneumokokker spres direkte via luftveiene til bronkier og lunge resulterer i livstruende CAP ^4,13. Lungeinfeksjoner er ofte ledsaget med vev og barriere ødeleggelse, og dermed gjør den patogen å spre seg inn i blodet og forårsaker IPD. Forekomst av CAP og IPD er høyest hos immunsupprimerte personer eller på ytterpunktene av alder ^4,13. De ansvarlig for konvertering fra en commensal til et patogen med høy virulens er fortsatt under debatt. Imidlertid, i tillegg til endringer i verts mottakelighet og evolusjonære tilpasning sammen med økt virulens, og økningen i antibiotiske motstandsverdier har blitt foreslått å ha en avgjørende virkning på PNEumococcal infeksjoner ^14-16.

Den patogen er utstyrt med et mangfold av adhesiner som medierer intim kontakt å mucosal epitelceller. Etter surmounting luftveiene slim, er pneumokokk tilslutning til vertsceller tilrettelagt via direkte interaksjoner av overflateeksponert adhesiner med cellulære reseptorer og ved å utnytte ekstracellulære matrix komponenter eller serumproteiner som bridging molekyler ^4,17,18. Som allsidig patogener pneumokokker er også utstyrt med faktorer involvert i unndragelse av vertens immunforsvarsmekanismer. Dessuten har de evnen til å tilpasse seg forskjellige verts miljøer slik som i lunge, blod og spinalvæske (CSF), henholdsvis ^5,17,19,20.

Virkningen av bakterielle faktorer på patogenese og inflammatorisk vertsresponser er undersøkt i eksperimentelle dyremodeller av lungebetennelse, bakteriemi, eller hjernehinnebetennelse ^21-25. Til tross for å være et menneskelig patogen, disse modellene er vill-etablert for å dechiffrere pneumokokk vev tropisme, virulensmekanismer, eller protectivity av pneumokokk vaksine kandidater. Den genetiske bakgrunnen til innavlede musestammer bestemmer mottakelighet for pneumokokker. BALB / c-mus intranasalt infisert med pneumococci ble funnet å være motstandsdyktige, mens CBA / Ca-og SJL mus var mer mottagelige mot pneumokokkinfeksjon ^22. Dette medfører at, i likhet med mennesker, den genetiske bakgrunn og vertsforsvarsmekanismer bestemme resultatet av infeksjon. Derfor er ytterligere innsats er nødvendig for å løse motstand loci i genomet hos mus mindre utsatt for pneumokokkinfeksjoner. Funnene har ført til endringer i in vivo virulens protokoller. I stedet for den innavlede BALB / c mus ofte brukt i det siste, er de svært mottakelige CD-1/MF1 utavmusestammer i dag ofte brukt for å studere effekten av tap-av-funksjon pneumokokk virulens eller egnethet faktorer ^26-28. Videre tilgjengelighetenbioluminescerende pneumokokker og optiske avbildningsteknikker gjør at sanntids Bioluminescens Bioimaging av infeksjoner. I pneumokokker den optimaliserte luxABCDE genet kassett (plasmid Paul-En Tn 4001 luxABCDE Km ^r) har blitt satt inn i en enkelt integrering stedet av kromosom ved transposon mutagenese. Bioluminescent pneumokokker har blitt ansatt for å vurdere demping av pneumokokk-mutanter mangelfull i virulens eller fitness faktorer og deres trans fra en anatomisk område til et annet ^26,28-31.

Her gir vi en protokoll for Bioimaging av pneumokokkinfeksjon i en murine lungebetennelse eller blodforgiftning modell. Forsterkning og formidling av selvlysende pneumokokker i intranasalt eller intraperitonealt infiserte mus kan enkelt overvåkes over tid ved hjelp av en optisk imaging system og samme dyr ved ulike tidspunkt.

Protocol

De dyr smitteforsøk er beskrevet her må utføres i henhold til de lokale og internasjonale (f.eks European Health Law of the Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA)) retningslinjer og forskrifter for bruk av virveldyr. Forsøkene må godkjennes av den lokale etiske styret and Institutional Animal Care Committee. Alle eksperimenter med S. pneumoniae i laboratoriet eller dyre infeksjoner er gjennomført i en klasse II biosikkerhet kabinettet. En. Forbere…

Representative Results

Oppkjøpet og opptak av metionin er av sentral betydning for pneumokokker å opprettholde fitness i verts nisje 32,33. Den metionin ABC transporter lipoprotein er kodet i D39 ved spd _ 0151 genet (TIGR4: sp_0149) og oppkalt MetQ 32. Pneumokokker videre produsere metionin biosyntese enzymer (D39: Spd_0510 – Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 – Sp_0586, Mete og METF). Mangelen på metionin i et kjemisk definert medium påvirker veksten av pneumokokker og lignende, mangelen av metionin…

Discussion

Alle eksperimenter utført på dyr må være godkjent av lokale myndigheter og etikk provisjoner. I in vivo-smitteforsøk bakteriemengden i de forskjellige verts nisjer av infiserte dyr har til å bli bestemt ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon. Under disse eksperimentelle betingelser dyrene måtte ofres forut for isolering av bakterier fra blod, nasofarynks, bronchoalvelar kylling, eller organer som lunger, milt og i hjernen. For å beregne antall bakterier per vert nisje og vurdere effekten av …

Materials

Todd Hewitt broth	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	X936.1
Yeast extract	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2363.2
Blood agar plates	Oxoid, Wesel, Germany	PB5039A
Kanamycin	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	T832.2
Erythromycin	Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany	E6376
fetal bovine serum (FBS)	PAA Laboratories, Coelbe, Germany	A11-151
CD-1 mice, female	Charles River, Sulzfeld, Germany	CD1SIFE06W08W	female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500mg, Curamed injection solution	Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution	Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes	Becton Dickinson, Heidelberg, Germany	300015	sterile Luer-Lok™ syringes with needle
Gel Loader Tips	peqlab	81-13790	MµltiFlex™ Tips
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3884-100mg	Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen	Air Liquide, Düsseldorf, Germany	M1001L50R2A001
Isofluoran	Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy	Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides	Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit	Qiagen, Hilden, Germany	27104
PCR DNA purification kit	Qiagen, Hilden, Germany	28106
Equipment
Living Image 4.1 software	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System	Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer	Eppendorf AG, Hamburg, Germany