光动力疗法治疗骨肉瘤细胞的细胞毒功效<em>体外</em

Summary

这里所报告的协议允许光动力疗法（PDT）中的细胞系和的PDT设置施加治疗在动物模型中之前，优化的效果进行评价。

Abstract

近年来，出现了在寻找更有效的治疗对癌症具有较少的全身性副作用的困难。因此，光动力疗法是一种新的方法对多种肿瘤有选择性的治疗。

光动力疗法（PDT），使一个无毒的光敏剂（PS），其中，经活化的光在氧的存在下的特定波长的光，产生氧自由基，引发细胞毒性反应¹的使用。尽管其批准几乎是二十年前由美国FDA，PDT是时下唯一用于治疗癌症类型（皮肤，膀胱）和nononcological疾病（牛皮癣，光化性角化病^）2的数量有限。

利用光动力疗法的主要优点是能够执行一个局部治疗，以防止全身性副作用的能力。此外，它可以让肿瘤在细腻的部位治疗（ 如周围神经或血管）。这里，一个intraoperatPDT的IVE应用被认为是在骨肉瘤（OS），肿瘤的骨，针对原发肿瘤的卫星遗留在肿瘤外科手术切除肿瘤后，周围的组织。治疗的目标是减少复发的数量以及减少为（术后）转移的风险。

在本研究中，我们提出在体外 PDT程序以建立有效的治疗方法，用于重现人类疾病中确立intratibial OS的小鼠模型中广泛使用的操作系统的细胞系的最优PDT设置。在PS mTHPC的吸收进行了检查用分光光度计和光毒性被挑起与mTHPC的激光激发在652 nm到诱导细胞死亡评估用WST-1法和存活细胞计数。所建立的技术使我们能够确定最佳PDT设置在动物模型中未来的研究。他们是一个简单而快速的工具，用于PDT的疗效评价<em>在体外体内应用程序之前。

Introduction

骨肉瘤（OS）的艺术处理今天的状态，原发性骨肿瘤，包括为新辅助化疗和手术的组合。这个治疗方案显示增加的患者从使用化疗前约20％的局部疾病的存活率，到目前的^{60-70％3,4。}然而，在过去的二十年中，操作系统患者局部病变的总生存期已趋于稳定^4，5。此外，这些患者中30％-40％在确诊后3年内复发和转移性疾病继续有^20-30％4一个贫穷的生存^，6，7。为了改善这些患者的预后，新的治疗策略需要发展。

光动力疗法（PDT），一个相当新颖的抗癌疗法，采用特定波长光的一个photosensi的激励光敏剂（PS），其中其注射到血液中后积聚在肿瘤细胞。在PS的激光激发产生的氧自由基在氧的存在下，其诱导肿瘤细胞和细胞死亡的细胞毒反应。除了这个主要机制，另外两个PDT诱发的生物学过程有助于减少肿瘤的生长：PDT引起血管收缩和血栓形成的肿瘤微血管，因而局部缺氧及缺氧的肿瘤内，导致肿瘤梗死。最后，PDT受伤和死亡的肿瘤细胞引发局部免疫反应，一个很独特的PDT的功能。这涉及补体系统和抗原的活化呈递树突状细胞^8。因此，条件是肿瘤抗原与淋巴样细胞，随后激活的演示文稿中创建，导致肿瘤特异性免疫。

到目前为止，PDT已被用于治疗多种类型的软组织肿瘤和hyperpl亚洲，如光化性角化病，Barrett食管，支气管内肿瘤，膀胱癌，基底细胞癌，和姑息治疗头颈部癌^2。治疗是已知的诱导局部，大规模坏死，只有很少的副作用，因此具有选择性地根除肿瘤组织的潜力。尽管有这些优势，PDT的应用程序保持技术上比化疗药物的管理更加严格。为了达到最大的效力，在PS的浓度，光照射时间和总的光能量传递需要被优化。这可以在体内实验来完成，但是，由于相对大量的需要被优化的参数的初步确定体外最佳条件下，它是更有效的。

在下面描述的实验中，我们使用PS 5,10,15,20 -四（间-羟基苯基）叶绿素测试PDT的体外功效奥林简称mTHPC（ 图1A）。 mTHPC是在医药品Foscan，这是目前在临床上对姑息治疗头部和颈部癌症的使用的活性物质。它是最有效的PS中的一个，在低浓度下已经大规模诱导的细胞损伤，并且它被证明是优于其它PS在组织穿透^9,10的条款。它的光吸收光谱（ 图1B）示出了两个显着的峰，一个在417 nm和第二在652纳米，这是用于积累PS的组织定位和对PDT诱导，分别。

目前，脂质体制剂用于mTHPC正在开发中。在这里，我们描述的程序来量化这种脂质体制剂的摄取，并且在两个人的OS细胞株进行PDT;低转移性居屋和高转移性143B细胞。一些这里介绍的数据已报告前面^11。钍这里描述É方法让我们来研究PDT疗效转移表型的影响。 143B细胞原位注射到免疫缺陷的SCID小鼠的后肢引起intratibial转移性原发性肿瘤，模型密切模仿人类转移性疾病。因此，建议在体外实验中是完全合适的，以评估在体内实验中用于以后的最佳PDT设置。

Protocol

1。 mTHPC在相应的低的吸收和高转移居屋和143B的OS细胞系的比较制备含有DMEM，含F12，并且在一个比4.5:4.5:1热灭活的胎牛血清的细胞培养基。 注意：在PS mTHPC的脂质体制剂溶解在水中以1.5毫克/毫升mTHPC的最终浓度。 板0.2×10 6个居屋和143B细胞/孔在6孔板中（一式三份对各条件），并让细胞贴壁过夜。 注意：该数量必须调节到个体的细胞系。 8…

Representative Results

与此报告的技术，我们研究mTHPC为基础的PDT在人类OS细胞。首先，mTHPC的时间和剂量依赖性摄取研究在低转移性居屋和在高转移性143B OS细胞系。 mTHPC摄取可以通过测量mTHPC的荧光用荧光分光光度计（ 图2中 ，再现从雷迪等人 11的许可）进行评估。 图2A示出mTHPC的时间依赖性摄取。将细胞悬浮液的荧光强度表示mTHPC的胞内水平。 图2B示出了剂量依赖?…

Discussion

为了实现在响应PDT最佳的细胞毒性，关键是要选择合适的激光设置和孵育时间。这里所描述的过程是一致的，高效的，确定的PS吸收和量化PDT诱导的细胞毒性体外 。使用PS mTHPC的特定吸收波长，蜂窝PS摄取可以以直接的方式来确定，并且PS可以被激活，以产生细胞毒性的活性氧物种。

利用这种体外设置中，所有的参数，如聚苯乙烯浓度，药物的光的时间间隔和激?…

Materials

DMEM	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-883
HAM F12	PAA GmbH, Freiburg, Germany	E15-817
heat-inactivated fetal calf serum	GIBCO, Basel, Switzerland	10500-064
mTHPC	biolitec research GmbH, Jena, Germany		As this liposomal formulation is originating from R & D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1	Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser	Biolitec AG, Jena, Germany	LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent	Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland	1644807